一种制备雌性胚胎致死家蚕品系的方法及其中间品系和构建体技术

本发明专利技术公开了一种制备雌性胚胎致死家蚕品系的方法及其中间品系和构建体。将家蚕品系W‑Cas9和家蚕品系Tra2‑sgRNA交配，获得G2代，即雌性胚胎致死家蚕品系。制备W‑Cas9的方法包括以下步骤：1)制备TALEN双质粒，其中左边TALEN识别序列为序列表中SEQ ID NO:1，右边TALEN识别序列为序列表中SEQ ID NO:2，体外转录获得TALENs mRNA；2)构建配体质粒，其包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：TALENs靶点、左同源臂、Cas9基因表达盒、右同源臂和TALENs靶点；3)共转家蚕新鲜卵得G0代，G0代自交得G1代，即得。本发明专利技术利用TALENs和CRISPR/Cas9技术在家蚕中定点靶向胚胎发育必须基因，致使胚胎发育期所有雌性均致死，从而建立家蚕雄性专养品系，可以大幅提高家蚕生丝品质。

A Method for Preparing Female Embryo-lethal Silkworm Strains and Their Intermediate Strains and Constructors

【技术实现步骤摘要】
一种制备雌性胚胎致死家蚕品系的方法及其中间品系和构建体
本专利技术属于生物
，涉及一种制备雌性胚胎致死家蚕品系的方法及其中间品系和构建体。
技术介绍
家蚕是一种具有很高经济价值的绢丝昆虫，同时也是鳞翅目昆虫模式昆虫，在我国经济生产和文化历史上具有重要地位。家蚕蛹的雌雄有着不同的特征，从外形特征来比较，雌蛹较大，腹部末端较圆；雄蛹较小，腹部末端较尖。从性特征比较，雌蛹第八环节腹面中央，从前端到后端有“X”状纵线；雄蛹第九环节腹面的中央有一个凹陷小点。根据上述描述的特征，在传统的家蚕遗传育种工作中，育种人员通过鉴别家蚕蛹的雌雄特异性特征从而鉴别雌雄，但是这项工作是一个非常耗时耗力的环节，极大地限制了家蚕育种的工作效率。不仅如此，家蚕幼虫发育期间无法辨别家蚕的性别，而家蚕雄性蚕茧的茧层率要显著高于雌性蚕茧，这为雄性专养带来了困扰。在家蚕中，外源基因的表达主要依赖于转基因技术。转基因技术是利用分子生物学的手段，将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，使外源基因在染色体基因组内稳定整合，并且能够遗传给后代。转基因昆虫的研究最早起始于1982年Rubin和Spradling利用P转座子将外源基因转入果蝇生殖细胞系获得稳定遗传的转基因果蝇，这无论对于基础研究还是应用都是一个意义深远的转折点，为转基因昆虫的研究工作打开了一扇门。2000年，Tamura首次使用PiggyBac转座子为基础构建了两个载体，一个是以A3启动子控制GFP为报告基因的转基因载体，另一个是表达转座酶的辅助载体，两种载体以一比一的量显微注射进蚕卵，从而在G1代获得稳定遗传的转基因家蚕，这标志转基因家蚕时代的到来。然而，以Piggybac转座子为载体的转基因的插入位点是随机的，在后代中有可能发生转移，这些对于目的基因的稳定遗传都是一种挑战。目前还没有通过分子遗传育种的方法获得稳定的雄性专养的家蚕品系。
技术实现思路
本专利技术针对缺乏稳定的雄性专养的家蚕品系的不足，提供一种制备雌性胚胎致死家蚕品系的方法及其中间品系和构建体。为此，本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供一种制备雌性特异性表达绿色荧光蛋白和Cas9蛋白的家蚕品系W-Cas9的方法，包括以下步骤：1)制备TALEN双质粒，其中左边TALEN识别序列为序列表中SEQIDNO:1所示，右边TALEN识别序列为序列表中SEQIDNO:2所示，体外转录获得其TALENsmRNA；2)构建配体质粒，所述的配体质粒包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：TALENs靶点、左同源臂、Cas9基因表达盒、右同源臂和TALENs靶点，所述的TALENs靶点包含从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：所述的左边TALEN识别序列、间隔序列和所述的右边TALEN识别序列，所述的左同源臂的序列和家蚕的基因组中TALENs靶点的左侧序列相同，所述的右同源臂的序列和家蚕的基因组中TALENs靶点的右侧序列；3)将所述的配体质粒和所述的TALENsmRNA共转家蚕新鲜卵，孵化，饲养，化蛾，得G0代，使G0代自交，获得G1代，即雌性特异性表达绿色荧光蛋白和Cas9蛋白的家蚕品系W-Cas9。优选的，所述的Cas9基因表达盒包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：Nos启动子，Cas9蛋白编码序列和SV40终止子。更优选的，所述的Nos启动子序列参见专利“家蚕生殖腺特异表达的启动子及其捕获方法”(专利申请号201610360601.2，陈容梅等，2016)。更优选的，Cas9基因的序列如SEQIDNO:6所示。更优选的，SV40终止子序列如SEQIDNO:7所示。优选的，所述的配体质粒还包括位于所述的左同源臂和所述的Cas9基因表达盒之间，或者位于所述的Cas9基因表达盒和所述的右同源臂之间的第一筛选标记基因表达盒。更优选的，所述的第一筛选标记基因是绿色荧光蛋白基因。所述的间隔序列是常规的，优选如SEQIDNO:5所示。优选的，所述的共转是将所述的配体质粒和可表达Piggybac转座酶的PHA3PIG质粒混合后所得的混合液显微注射家蚕新鲜卵。本专利技术还提供一种制备表达Tra2特异性sgRNA的家蚕品系Tra2-sgRNA的方法，包括以下步骤：1)构建转基因质粒，所述的转基因质粒包括第一sgRNA表达盒和第二sgRNA表达盒，所述的第一sgRNA表达盒包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：第一U6启动子，第一Tra2基因靶点和第一sgRNA保守序列，所述的第二sgRNA表达盒包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：第二U6启动子，第二Tra2基因靶点和第二sgRNA保守序列，2)将所述的转基因质粒和可表达Piggybac转座酶的PHA3PIG质粒共转家蚕新鲜卵，孵化，饲养，化蛾，得G0代，使G0代自交，获得G1代，即表达Tra2特异性sgRNA的家蚕品系Tra2-sgRNA。优选的，所述的第一Tra2基因靶点的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示，所述的第二Tra2基因靶点的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。所述的U6启动子是常规的，优选的为SEQIDNO:8所示。所述的sgRNA保守序列是常规的，优选的为SEQIDNO:9所示。优选的，所述的转基因质粒还包括第二筛选标记基因表达盒。更优选的，所述的第二筛选标记基因是红色荧光蛋白基因。本专利技术还提供一种制备雌性胚胎致死家蚕品系的方法，包括以下步骤：将家蚕品系W-Cas9和家蚕品系Tra2-sgRNA交配，获得G2代，即雌性胚胎致死家蚕品系。本专利技术的优点在于：本专利技术利用TALENs和CRISPR/Cas9技术在家蚕中定点靶向胚胎发育必须基因，致使胚胎发育期所有雌性均致死，从而达到专养雄蚕的效果。利用该方法建立家蚕雄性专养品系，可以大幅提高家蚕生丝品质，具有重要的应用价值。附图说明图1为家蚕W染色体定点插入GFP基因和Cas9基因的配体质粒构建。用pGEM-T质粒构建目的配体质粒，在多克隆酶切位点插入GFP基因和Cas9基因表达框、同源臂、TALENs靶点(TS)(实施例2)。图2为配体质粒pGEM-T_TS-L-Homo_HR5-IE1-EGFP-SV40_Nos-Cas9-SV40_R-Homo-TS在家蚕胚胎期、幼虫期、蛹期和成虫期的表达。分别在白光、绿色荧光下观察雌雄个体的荧光表达(实施例5)。图3JunctionPCR证实了Donor整合在TALENs靶标位点处。引物S-F1与S-R1位于Donor同源区域外侧，引物S-F2与S-R2均位于EGFP基因和Cas9基因内侧(A)。使用引物S-F1和S-R1可以扩增出长度为～1.4kb的5’-Junction片段，使用引物S-F2和S-R2可以扩增出长度～1.4kb的3’-Junction片段(B)(实施例6)。图4为家蚕孵化率统计。对照组家蚕胚胎能够正常孵化(A)，实验组Tra2-sgRNA品系和Tra2-sgRNA品系杂交后代中部分胚胎不能孵化(B)。对照组家蚕孵化率为99％；实验组孵化率为49％(C)(实施例7)。图5为家蚕雌性特异性致死。对照组家蚕蛹期雌雄比例相似，实验组Tra2-sgRNA品系和Tra2-sgRNA品系杂交后代仅有雄蛹(实施例8)。具体实施方式本专利技术人经过广泛的研究本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备雌性特异性表达绿色荧光蛋白和Cas9蛋白的家蚕品系W‑Cas9的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)制备TALEN双质粒，其中左边TALEN识别序列为序列表中SEQ ID NO:1所示，右边TALEN识别序列为序列表中SEQ ID NO:2所示，体外转录获得其TALENs mRNA；2)构建配体质粒，所述的配体质粒包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：TALENs靶点、左同源臂、Cas9基因表达盒、右同源臂和TALENs靶点，所述的TALENs靶点包含从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：所述的左边TALEN识别序列、间隔序列和所述的右边TALEN识别序列，所述的左同源臂的序列和家蚕的基因组中TALENs靶点的左侧序列相同，所述的右同源臂的序列和家蚕的基因组中TALENs靶点的右侧序列；3)将所述的配体质粒和所述的TALENs mRNA共转家蚕新鲜卵，孵化，饲养，化蛾，得G0代，使G0代自交，获得G1代，即雌性特异性表达绿色荧光蛋白和Cas9蛋白的家蚕品系W‑Cas9。

【技术特征摘要】
1.一种制备雌性特异性表达绿色荧光蛋白和Cas9蛋白的家蚕品系W-Cas9的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)制备TALEN双质粒，其中左边TALEN识别序列为序列表中SEQIDNO:1所示，右边TALEN识别序列为序列表中SEQIDNO:2所示，体外转录获得其TALENsmRNA；2)构建配体质粒，所述的配体质粒包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：TALENs靶点、左同源臂、Cas9基因表达盒、右同源臂和TALENs靶点，所述的TALENs靶点包含从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：所述的左边TALEN识别序列、间隔序列和所述的右边TALEN识别序列，所述的左同源臂的序列和家蚕的基因组中TALENs靶点的左侧序列相同，所述的右同源臂的序列和家蚕的基因组中TALENs靶点的右侧序列；3)将所述的配体质粒和所述的TALENsmRNA共转家蚕新鲜卵，孵化，饲养，化蛾，得G0代，使G0代自交，获得G1代，即雌性特异性表达绿色荧光蛋白和Cas9蛋白的家蚕品系W-Cas9。2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述的Cas9基因表达盒包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：Nos启动子，Cas9蛋白编码序列和SV40终止子；或者，所述的配体质粒还包括位于所述的左同源臂和所述的Cas9基因表达盒之间，或者位于所述的Cas9基因表达盒和所述的右同源臂之间的第一筛选标记基因表达盒；或者，所述的共转是将所述的配体质粒和可表达Piggybac转座酶的PHA3PIG质粒混合后所得的混合液显微注射家蚕新鲜卵。3.如权利要求2所述方法，其特征在于，所述的第一筛选标记基因是绿色荧光蛋白基因。4.一种制备表达Tra2特异性sgRNA的家蚕品系Tra2-sgRNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)构建转基因质粒，所述的转基因质粒包括第一sgRNA表达盒和第二sgRNA表达盒，所述的第一sgRNA表达盒包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：U6启动子，第一Tra2基因靶点和sgRNA保守序列，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄勇平，张忠杰，许军，李恺，谭安江，牛宝龙，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：上海,31