一种超耐热的木聚糖酶XynGold及基因与应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，涉及一种超耐热的木聚糖酶XynGold及基因与应用。所述木聚糖酶XynGold的核心氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述木聚糖碱基序列与SEQ ID NO：3的序列具有95％以上的同一性。本发明专利技术显著提高了人工合成的木聚糖酶基因xyngold在毕赤酵母细胞中的表达量，显著提高了木聚糖酶的活性、温度稳定性和表达水平，获得了在毕赤酵母中高水平表达的、高酶活力、耐高温的木聚糖酶及基因。

XynGold, an ultra-heat-resistant xylanase, and its gene and Application

【技术实现步骤摘要】
一种超耐热的木聚糖酶XynGold及基因与应用
本专利技术属于基因工程
，更具体地，涉及一种超耐热的木聚糖酶XynGold及基因序列、以及重组表达载体、重组表达菌株、该木聚糖酶XynGold的应用和一种水解木聚糖的方法。
技术介绍
木聚糖是存在于植物细胞壁中的半纤维素类物质的主要成分。它约占细胞干重的15％～35％。木聚糖是自然界中仅次于纤维素的第二大可再生多糖类资源。但是木聚糖只有被木聚糖酶水解为短链的木寡糖和木糖等小分子物质后才能被生物体利用。木聚糖酶是一类能够将木聚糖水解为木糖或木寡糖的酶。它主要包括β-1,4-内切酶，β-1,4-外切酶和木糖苷酶等。其中β-1,4-内切酶发挥主要的水解作用。该酶作用于木聚糖的β-1,4-木糖苷键，将木聚糖水解为木糖、木二糖、木三糖等不同长度的可被生物体利用的小分子糖类。一般工业上生产的木聚糖酶主要来源于青霉(Penicillium)、木霉(Trichodermi)、曲霉(Aspergilli)、芽胞杆菌(Bacillus)、链霉菌(Streptomycetes)和瘤胃纤维菌(Rumihococci)等。木聚糖酶广泛应用于各个工业领域。在饲料工业中，饲料中的麸皮、小麦等谷物类原料含有大量的木聚糖。动物饲用含木聚糖的饲料后易在肠道内形成食糜不利于消化吸收，形成强烈的抗营养性。在饲料中添加木聚糖酶可以使木聚糖变为可被肠道消化利用的单糖和寡糖，从而提高饲料的营养价值。在面包烘焙行业，木聚糖酶可以提高面团的机械加工能力，使面团柔软且易于拉伸、延缓老化。在果汁加工行业，木聚糖酶可以使其澄清、口感清新。在造纸领域，木聚糖酶能有效去除木质素，促进纸张的漂白。木聚糖酶在生物燃料的生产过程中也发挥着重要的作用。尽管木聚糖酶在食品、饲料、造纸等领域具有广泛的应用前景，但仍然存在需要解决的关键问题：1)酶的比活力低。天然存在的木聚糖酶活性普遍较低，对木聚糖的水解效率低。2)木聚糖酶在工业生产中产量较低，生产成本较高。3)木聚糖酶的高温稳定性较差，特别是在饲料工业中，高温制粒工艺易使不耐热的木聚糖酶失去活性。因此，需要对木聚糖酶进行改造来提高酶对温度的稳定性，提高其表达水平。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高水平表达的超耐热木聚糖酶XynGold及基因序列、以及重组表达载体、重组表达菌株、该木聚糖酶XynGold的应用和一种水解木聚糖的方法。为了实现上述目的，本专利技术提供一种超耐热的木聚糖酶XynGold，所述木聚糖酶XynGold的核心氨基酸序列含有SEQIDNO：1所示的氨基酸序列。根据本专利技术，SEQIDNO：1所示的氨基酸序列为核心序列，所述木聚糖酶XynGold的氨基酸序列含有SEQIDNO：1所示的氨基酸序列即可实现本专利技术的效果。进一步优选地，所述木聚糖酶XynGold的氨基酸序列为SEQIDNO：1所示的氨基酸序列。根据本专利技术，所述木聚糖酶XynGold由木聚糖酶Xyn通过点突变得到，所述木聚糖酶Xyn的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。具体的突变包括：将原始木聚糖酶Xyn序列中68位的天冬酰胺突变为谷氨酰胺(N68Y)，将96位的谷氨酸突变为色氨酸(E96W)。所述点突变可采用本领域常规的各种突变方法，其具体操作步骤为本领域技术人员公知，在此不再赘述。本专利技术的第二方面提供一种木聚糖酶基因xyngold，用于编码木聚糖酶XynGold。具体地，所述木聚糖酶基因xyngold的碱基序列与SEQIDNO：3所示的碱基序列具有95％以上的同一性。优选地，所述的木聚糖酶基因xyngold含有SEQIDNO：3所示的碱基序列。在最优选情况下，本专利技术所述的木聚糖酶xyngold的碱基序列为SEQIDNO：3所示的碱基序列。本专利技术提供的木聚糖酶基因xyngold，系基于木聚糖酶氨基酸序列人工设计。与原始的木聚糖酶基因xyn(SEQIDNO：4)相比，本专利技术的木聚糖酶基因xyngold采用了在毕赤酵母中高频使用的密码子，从而显著提高了人工设计的木聚糖酶基因xyngold在毕赤酵母细胞中的表达量。本专利技术根据木聚糖酶的氨基酸序列，人工设计出一条全新的木聚糖酶基因序列，并通过人工合成的方法获得所述木聚糖酶基因片段，其碱基序列如SEQIDNO：3所示，命名为xyngold，所述木聚糖酶基因xyngold编码出的木聚糖酶的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术的木聚糖酶基因xyngold表达出的木聚糖酶XynGold的适宜温度为90～100℃，最优选为100℃。本专利技术的第三方面提供一种重组表达载体，其包括上述木聚糖酶基因xyngold，还可包括其他功能单元。在木聚糖酶XynGold的氨基酸序列和木聚糖酶基因xyngold的碱基序列确定的情况下，本领域技术人员能够选择合适的重组表达载体以及其他功能单元，例如，毕赤酵母表达载体。本专利技术对所述重组表达载体的制备方法没有特别限定，可根据本领域常规技术手段确定。根据本专利技术一种具体实施方式，所述重组表达载体的制备方法包括以下步骤：将合成的木聚糖酶基因xyngold连接至表达载体中。在本专利技术的一些实施例中，所述表达载体为毕赤酵母表达载体pPICZαA。当然，在本专利技术其他实施例中，也可选用其他毕赤酵母表达载体。根据本专利技术一种更加具体的实施方式，所述重组表达载体的制备方法包括如下步骤：将合成的木聚糖酶基因xyngold通过限制性内切酶EcoRI和XbaI酶切，获得具有粘性末端的木聚糖酶基因xyngold片段；将毕赤酵母表达载体pPICZαA通过限制性内切酶EcoRI和XbaI酶切，获得具有粘性末端的pPICZαA片段；将木聚糖酶基因xyngold片段和pPICZαA片段通过T4DNA连接酶连接，获得pPIC-xyngold重组表达质粒。本专利技术的第四方面提供一种重组表达菌株，其表达产物为上述木聚糖酶XynGold。在木聚糖酶XynGold的氨基酸序列确定的情况下，本领域技术人员能够获得合适的重组表达菌株。通常来说，所述宿主细胞可以是大肠杆菌、芽孢杆菌、曲霉，也可以是酵母等细胞，或者是其他类型的细胞，例如动物细胞等。优选地，所述重组表达菌株的宿主细胞为毕赤酵母。同时，本专利技术提供的木聚糖酶基因xyngold经过密码子优化，采用了适合于毕赤酵母进行转录翻译表达出木聚糖酶的高频密码子，提高了木聚糖酶基因xyngold在毕赤酵母细胞中的表达量。本专利技术对所述重组表达菌株的制备方法没有特别限定，可根据本领域常规技术手段确定。根据本专利技术一种具体实施方式，所述重组表达菌株的制备方法包括如下步骤：将重组表达载体通过限制性内切酶线性化；将上述线性化片段导入毕赤酵母中，获得重组表达菌株。可选地，通过电转将重组表达载体导入毕赤酵母宿主细胞中，获得重组表达菌株。在本专利技术的一些实施例中，所述毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母X-33，当然，在本专利技术其他实施例中，也可选用其他毕赤酵母菌株。根据本专利技术一种更加具体的实施方式，所述重组表达菌株的制备方法包括如下步骤：将pPIC-xyngold重组表达质粒通过BglII限制性内切酶线性化；通过电转化法将线性化的pPIC-xyngold导入毕赤酵母宿主细胞中，获得重组表达菌株。本专利技术中，重组表达菌株制备木聚糖酶的方法可以采用本领域常规的方法。根据本本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种超耐热的木聚糖酶XynGold，其特征在于，所述木聚糖酶XynGold的氨基酸序列含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种超耐热的木聚糖酶XynGold，其特征在于，所述木聚糖酶XynGold的氨基酸序列含有SEQIDNO：1所示的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的木聚糖酶XynGold，其特征在于，所述木聚糖酶XynGold的氨基酸序列为SEQIDNO：1所示的氨基酸序列。3.根据权利要求2所述的木聚糖酶XynGold，其特征在于，所述木聚糖酶XynGold由木聚糖酶Xyn通过点突变得到，所述木聚糖酶Xyn的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。4.一种木聚糖酶基因xyngold，用于编码权利要求1-3中任意一项所述的木聚糖酶XynGold，其特征在于，所述木聚糖酶基因xyngold的碱基序列与SEQIDNO：3所示的碱基序列具有95％以上的同一性。5.根据权利要求4所述的木聚糖...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨江科，上官芳，韩正刚，
申请(专利权)人：武汉轻工大学，中国大洋矿产资源研究开发协会中国大洋事务管理局，
类型：发明
国别省市：湖北,42