同步检测黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A 和玉米赤霉烯酮的免疫层析试纸条制造技术

本发明专利技术涉及同步检测黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条。其包括底板，底板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上横向设有质控线和检测线，所述检测线位于质控线的下方，个数为四条，呈间隔分布，分别包被有各毒素蛋白偶联物，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体；所述抗环匹阿尼酸单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201871的杂交瘤细胞株YTT‑2分泌产生。其可用于样品中黄曲霉毒素、环匹阿尼酸，赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮四种真菌毒素含量的同步检测，具有操作简单、快速、灵敏度高的特点。

Immunochromatographic strip for simultaneous detection of aflatoxin, cyclopianic acid, ochratoxin A and zearalenone

【技术实现步骤摘要】
同步检测黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的免疫层析试纸条
本专利技术属生物检测领域，具体涉及一种同步检测黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮多毒素混合污染的免疫层析试纸条及制备方法。
技术介绍
真菌毒素是真菌在生长过程中产生的有毒次级代谢产物，农产品在收获后处理不当，导致温度或湿度过高，可能引起真菌的生长繁殖，以及真菌毒素的污染。黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮是农产品中常见的真菌毒素。黄曲霉毒素与环匹阿尼酸是黄曲霉和寄生曲霉等产生，赭曲霉毒素是由曲霉和青霉产生，玉米赤霉烯酮是由镰刀菌产生，四种真菌毒素在农产品包括大米、玉米、花生、小麦、高粱、饲料等粮食与饲料中广泛发生。真菌毒素对人和动物具有极大的危害，黄曲霉毒素是Ⅰ类致癌物质，具有诱导突变、抑制免疫和致癌的作用，主要作用于肝脏；环匹阿尼酸可导致心细胞变性，胞膜通透性增加，神经元坏死；赭曲霉毒素对肝脏与肾脏的毒害，大量毒素也可能引起动物的肠粘膜炎症和坏死；玉米赤霉烯酮具有雌激素毒性作用，能造成动物急慢性中毒，引起动物繁殖技能异常甚至死亡。鉴于真菌毒素的危害作用及其在农产品与饲料的广发发生，世界各国对其含量进行了严格的限定。随着人们对食品安全要求的提高，需要加强农产品中真菌毒素的检测，开发安全、可靠的检测技术，提高我国食品安全水平。现有的对黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮四种真菌毒素的检测方法主要包括薄层层析法、精密仪器分析法和免疫学分析法。薄层层析法检测真菌毒素时，不需要特殊的仪器设备，在一般实验室条件下都可进行，但检测试剂用量大、操作繁琐、其它组分干扰严重、准确性差，不能准确定量，且对实验人员和周围环境污染危害较大，不适于现场快速检测，其应用范围越来越窄。精密仪器分析法包括高效液相色谱法、液相色谱与质谱及串联质谱联用的方法，其灵敏度高，准确性好，但仪器昂贵，要求所检测的样品的纯化程度高，样品前处理过程繁琐，耗时长，对实验环境和检测人员要求高，难以实现快速检测，检测成本高，不适用于现场快速检测。免疫分析方法克服了薄层层析法和仪器分析法的缺点，由于其特异性强、灵敏度高、样品前处理简单、成本低、对实验人员和周围环境的污染危害小、适于现场批量检测等优点在近年来获得了快速发展。基于胶体金标记抗体与抗原特异性结合反应的免疫层析技术由于其检测结果肉眼可见，不需要大型仪器设备，检测成本低，分析时间短，近年来在真菌毒素等微量残留物的定性、在线、快速检测上得到了广泛应用。我国小农户分散型的种植方式，农产品中真菌毒素发生率高，且同一农产品受多种真菌毒素污染的可能性大，因此迫切需要能同步检测多种真菌毒素的检测技术，以实现对粮食及饲料等中真菌毒素混合污染的同步、快速监测。
技术实现思路
本专利技术所要解决的问题是提供一种同步检测黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的免疫层析试纸条及制备方法。其可用于样品中黄曲霉毒素、环匹阿尼酸，赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮四种真菌毒素含量的同步检测，具有操作简单、快速、灵敏度高的特点。为解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案为：同步检测黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条，包括底板，底板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上横向设有质控线和检测线，所述检测线位于质控线的下方，个数为四条，呈间隔分布，所述四条检测线上分别包被有黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物(AFB1-BSA)、环匹阿尼酸-卵清蛋白偶联物(CPA-OVA)、赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白偶联物(OTA-BSA)和玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物(ZEN-BSA)，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体；所述金标垫横向喷涂有纳米金标记的抗黄曲霉毒素单克隆抗体、纳米金标记的抗环匹阿尼酸单克隆抗体、纳米金标记的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体和纳米金标记的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体；所述抗环匹阿尼酸单克隆抗体由保藏编号为CCTCCNO.C201871的杂交瘤细胞株YTT-2分泌产生。按上述方案，所述抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体为抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体，由保藏编号为CCTCCNO.C201013的杂交瘤细胞株1C11分泌产生，抗赭曲霉毒素A单克隆抗体由保藏编号为CCTCCNO.C201329的杂交瘤细胞株1H2分泌产生，抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体由保藏编号为CCTCCNO.C201328的杂交瘤细胞株2D3分泌产生。按上述方案，所述的吸水垫长16～18mm，宽2～4mm；检测垫长25～30mm，宽2～4mm；金标垫长6～9mm，宽2～4mm；样品垫长12～18mm，宽2～4mm，相邻各垫的交叠长度为1～3mm。按上述方案，所述的吸水垫为吸水纸；所述的底板为纸板。按上述方案，所述检测垫上每相邻两条检测线之间的间距为2-3mm，靠近质控线的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为15～20mm，所述靠近质控线的检测线与质控线的间距为5～7mm。按上述方案，所述检测垫上每厘米检测线所需的黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物的包被量为100～300ng；每厘米检测线所需的环匹阿尼酸-卵清蛋白偶联物的包被量为80～400ng；每厘米检测线所需的赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白偶联物的包被量为100～300ng；每厘米检测线所需的玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物的包被量为100～300ng；每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为100～300ng。按上述方案，所述金标垫中所用的纳米金的粒径为15～20nm；所述金标垫上每厘米喷涂长度所需的纳米金标记的抗黄曲霉毒素单克隆抗体的用量为100～200ng，所述的纳米金标记的抗环匹阿尼酸单克隆抗体的用量为100～200ng，所述的纳米金标记的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体的用量为100～200ng，所述纳米金标记的的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体的用量为200～400ng。如上所述同步检测黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：(1)吸水垫的制备将吸水纸剪裁得吸水垫；(2)检测垫的制备检测线的包被：将黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物、环匹阿尼酸-卵清蛋白偶联物、赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白偶联物和玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物用包被缓冲液分别配制成0.25～0.5mg/mL的包被液，用线喷方式将包被液横向包被于硝酸纤维素膜上得到检测线，得到四条检测线，所述检测垫上每厘米检测线所需的黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物的包被量为100～300ng；每厘米检测线所需的环匹阿尼酸-卵清蛋白偶联物物的包被量为80～400ng；每厘米检测线所需的赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白偶联物的包被量为100～300ng；每厘米检测线所需的玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物的包被量为100～300ng；所述每相邻两条检测线之间的间距为2-3mm，靠近质控线的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为15～20mm；然后于37～40℃条件下干燥60～120分钟；质控线的包被：将兔抗鼠多克隆抗体用包被缓冲液配制成0.5mg/mL的包被液；于距检测线5～10mm的位置，用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.同步检测黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条，其特征在于：包括底板，底板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上横向设有质控线和检测线，所述检测线位于质控线的下方，个数为四条，呈间隔分布，所述四条检测线上分别包被有黄曲霉毒素B1‑牛血清白蛋白偶联物、环匹阿尼酸‑卵清蛋白偶联物、赭曲霉毒素A‑牛血清白蛋白偶联物和玉米赤霉烯酮‑牛血清白蛋白偶联物，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体；所述金标垫横向喷涂有纳米金标记的抗黄曲霉毒素单克隆抗体、纳米金标记的抗环匹阿尼酸单克隆抗体、纳米金标记的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体和纳米金标记的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体；所述抗环匹阿尼酸单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201871的杂交瘤细胞株YTT‑2分泌产生。

【技术特征摘要】
1.同步检测黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条，其特征在于：包括底板，底板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上横向设有质控线和检测线，所述检测线位于质控线的下方，个数为四条，呈间隔分布，所述四条检测线上分别包被有黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物、环匹阿尼酸-卵清蛋白偶联物、赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白偶联物和玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体；所述金标垫横向喷涂有纳米金标记的抗黄曲霉毒素单克隆抗体、纳米金标记的抗环匹阿尼酸单克隆抗体、纳米金标记的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体和纳米金标记的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体；所述抗环匹阿尼酸单克隆抗体由保藏编号为CCTCCNO.C201871的杂交瘤细胞株YTT-2分泌产生。2.根据权利要求1所述的同步检测黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条，其特征在于：所述抗黄曲霉毒素用单克隆抗体为由保藏编号为CCTCCNO.C201013的杂交瘤细胞株1C11分泌产生的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体，抗赭曲霉毒素A单克隆抗体由保藏编号为CCTCCNO.C201329的杂交瘤细胞株1H2分泌产生，抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体由保藏编号为CCTCCNO.C201328的杂交瘤细胞株2D3分泌产生。3.根据权利要求1所述的同步检测黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条，其特征在于：所述的吸水垫长16～18mm，宽2～4mm；检测垫长25～30mm，宽2～4mm；金标垫长6～9mm，宽2～4mm；样品垫长12～18mm，宽2～4mm，相邻各垫的交叠长度为1～3mm；所述的吸水垫为吸水纸；所述的底板为纸板。4.根据权利要求1所述的同步检测黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条，其特征在于：，所述检测垫上每相邻两条检测线之间的间距为2-3mm，靠近质控线的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为15～20mm，所述靠近质控线的检测线与质控线的间距为5～7mm。5.根据权利要求1所述的同步检测黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条，其特征在于：所述检测垫上每厘米检测线所需的黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物的包被量为100～300ng；每厘米检测线所需的环匹阿尼酸-卵清蛋白偶联物的包被量为80～400ng；每厘米检测线所需的赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白偶联物的包被量为100～300ng；每厘米检测线所需的玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物的包被量为100～300ng；每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为100～300ng。6.根据权利要求1所述的同步检测黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条，其特征在于：所述金标垫中所用的纳米金的粒径为15～20nm；所述金标垫上每厘米喷涂长度所需的纳米金标记的抗黄曲霉毒素单克隆抗体的用量为100～200ng，所述的纳米金标记的抗环匹阿尼酸单克隆抗体的用量为100～200ng，所述的纳米金标记的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体的用量为100～200ng，所述纳米金标记的的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体的用量为200～400ng。7.权利要求1所述的同步检测黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)吸水垫的制备将吸水纸剪裁得吸水垫；(2)检测垫的制备检测线的包被：将黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物、环匹阿尼酸-卵清蛋白偶联物、赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白偶联物和玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物用包被缓冲液分别配制成0.25～0.5mg/mL的包被液，用线喷方式将包被液横向包被于硝酸纤维素膜上得到检测线，得到四条检测线，所述检测垫上每厘米检测线所需的黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物的包被量为100～300ng；每厘米检测线所需的环匹阿尼酸-卵清蛋白偶联物物的包被量为80～400ng；每厘米检测线所需的赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白偶联物的包被量为100～300ng；每厘米检测线所需的玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物的包被量为100～300ng；所述每相邻两条检测线之间的间距为2-3mm，靠近质控线的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为15～20mm；然后于37～40℃条件下干燥60～120分钟；质控线的包被：将兔抗鼠多克隆抗体用包被缓冲液配制成0.5mg/mL的包被液；于距检测线5～10mm的位置，用线喷方式将包被液横向包被于硝酸纤维素膜上，得到质控线，每厘米质控线上所需兔抗鼠多克隆抗体的包被量为100～300ng，然后于37～40℃条件下干燥60～120分钟；(3)样品垫的制备将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37～40℃条件下干燥10～16小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存；(4)金标垫的制备将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37～40℃条件下干燥10～16小时，于已干燥的玻璃纤维膜上，用点喷方式向已干燥的玻璃纤维膜上横向喷涂纳米金标记的抗黄曲霉毒素单克隆抗体溶液、纳米金标记的抗环匹阿尼酸单克隆抗体溶液、纳米金标记的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体溶液和纳米金标记的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体溶液的混合溶液，其中：每厘米喷涂长度所需的纳米金标记的抗黄曲霉毒素单克隆抗体的用量为100～200ng，所需的纳米金标记的抗环匹阿尼酸单克隆抗体的用量为100～200ng，所需的纳米金标记的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体的用量为100～200ng，所需的纳米金标记的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体的用量为200～400ng，然后真空冷冻干燥2～4小时，置干燥器中室温保存；所述抗环匹阿尼酸单克隆抗体由保藏编号为CCTCCNO.C201871的杂交瘤细胞株YTT-2分泌产生；(5)试纸条的组装在底板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1～3mm，即得同步检测黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条。8.根据权利要求7所述的同步检测黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：所述检测线的包被中所使用的包被缓冲液为:1g牛血清白蛋白，0.02g叠氮化钠，0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至...

【专利技术属性】
技术研发人员：李培武，唐晓倩，姜俊，张奇，张文，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42