用于检测柯萨奇病毒A4型的试剂组合制造技术

本发明专利技术涉及用于检测柯萨奇病毒A4型的试剂组合，其包括：上游引物：5'‑ACATCCACCATACAGAGGGTCA‑3'；下游引物：5'‑GCTGTAGACGAAGCTCCT‑3'；和探针：5'‑CAACAGCCGCCAACACCAC‑3'。本发明专利技术提供了一种能够检测CA4的试剂组合，并达到较高的检测灵敏度。本发明专利技术还涉及该试剂组合在制备试剂盒中的用途；以及试剂盒。

Combination of reagents for detection of coxsackievirus A4

【技术实现步骤摘要】
用于检测柯萨奇病毒A4型的试剂组合
本专利技术涉及体外诊断领域，具体涉及一种用于检测柯萨奇病毒A4型的试剂组合。
技术介绍
柯萨奇病毒(Coxsackievirus，CV)最初于1948年由Dolldorf和Sickles在美国纽约州Coxsackie镇从临床诊断为脊髓灰质炎的患儿粪便中分离出来。柯萨奇病毒一种常见肠道病毒(Enterovirus)，分为A、B两组，其中A组病毒有24个血清型(A1～A24)，而B组病毒有6个血清型(B1～B6)。临床上，柯萨奇病毒感染诊断与分类的方法通常包括病毒培养、免疫学检验和核酸检测。其中，实时荧光定量PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，该技术使用带有荧光检测装置的PCR扩增仪，荧光检测装置能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平，试验结束后可通过软件自动分析获得扩增曲线，根据扩增曲线与荧光阈值线的交点(即Ct值)以及扩增曲线的形状，可以判断阴阳性结果。目前，对于柯萨奇病毒的一些常见血清型，如A6、A16型，已持续地进行了研究；针对它们的各自特点，研究者已设计出一些用于体外诊断的荧光定量PCR引物对和/或探针；它们中的一部分已经商业化并应用于基于实时荧光定量RCR的临床检测中。然而，由于此前柯萨奇病毒A4型的关注较少，其相对于A6、A16等血清型来说并不是研究热点，相关的报道寥寥；值得一提的是，国内尚无基于实时荧光定量PCR技术定量检测柯萨奇病毒A4型的商业化试剂盒。柯萨奇病毒A组4型(CA4)属于小RNA病毒科肠道病毒属成员，是导致手足口病发病的常见病原体。CA4在1950年首次出现在美国，1998年发展为肯尼亚株(GQ176232)、亚洲株(2008日本株AB457644)和亚洲欧洲株(GⅡ-A)3种基因型别。文献资料报道显示CA4感染还可引起急性迟缓性麻痹、疱疹性咽峡炎、无菌性脑膜炎等多种疾病。近年来手足口病病原谱发生变化，非EV71和非CA16病毒感染引起手足口病比例有所增加，其中CA4感染占肠道病毒感染病例数的构成比约为1％。已经有多个地区爆发了由CA4病毒感染引起的手足口病疫情，研究显示我国广州地区目前的CA4流行株也是主要流行株，是由原始株发生了明显的基因变化而快速产生的流行毒株。然而，国内外目前对CVA4的研究较少，且多限于对病毒株的分离和鉴定。继而，基于荧光定量PCR的柯萨奇病毒A4型检测试剂盒逐渐受到了关注。就这方面来说，中国专利公开CN102816869A提供了一组用于柯萨奇病毒A4实时荧光PCR检测引物和探针，其能够在25μl体系下检测50拷贝的CA4，即检测灵敏度为2000拷贝/mL。而对于CA4拷贝数较低的情况，该引物和探针组合则难以实现有效检测。因此，在本领域中，存在着其他CA4荧光PCR检测试剂，尤其是具有较高检测灵敏度的检测试剂的强烈需求。
技术实现思路
如前所述，如何基于荧光定量PCR的报道检测柯萨奇病毒A4型的问题已逐渐引起了人们的关注。而值得一提的是，由于对CA4检测的研究目前仍处于初期阶段，相关投入热度以及文献报道量均处于较低水平，因此在研发过程中所能借鉴参考的资料非常有限；相对于其他热门的血清型来说，这无疑给A4型检测的研究工作带来了更多困难。在大量工作的基础上，本专利技术提供一种基于荧光PCR的柯萨奇病毒A4型检测试；所述试剂组合可用于与柯萨奇病毒A4型的检测相关的用途，所述试剂组合包括：CA4F1上游引物：5'-ACATCCACCATACAGAGGGTCA-3'(SEQIDNo.1)；CA4R1下游引物：5'-GCTGTAGACGAAGCTCCT-3'(SEQIDNo.2)；和CA4P1探针：5'-CAACAGCCGCCAACACCAC-3'(SEQIDNo.3)。在具体的实施方式中，CA4F1与CA4R1可分别以0.1μmol/L～0.5μmol/L的浓度存在；CA4P1可以0.1μmol/L～0.5μmol/L的浓度存在。在具体的实施方式中，所述试剂组合用于柯萨奇病毒A4型的荧光定量PCR检测。在具体的实施方式中，所述探针的两端分别标记有报告荧光基团和淬灭荧光基团。例如，所述探针的5'端可标记有报告荧光基团，而3'端可标记有淬灭荧光基团。示例性的报告荧光基团可以是CY5、CalRed610、FAM、HEX、JOE、ROX、TET、TEXASRED和VIC等。示例性的荧光淬灭基团可以是BHQ1、BHQ2、BHQ3、Eclipse、TAMRA等。在优选的实施方式中，所述报告荧光基团为FAM。在优选的实施方式中，所述荧光淬灭基团为BHQ1。除上述引物与探针外，本专利技术的试剂组合还可以包括用于进行荧光定量PCR的其它反应试剂，如PCR反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、mMLV酶、TaqDNA聚合酶、阳性对照或阴性对照等。在具体的实施方式中，阳性对照可为已知浓度的假病毒。在具体的实施方式中，阴性对照可为灭菌生理盐水。在优选的实施方式中，为了预防由于样本中可能存在的PCR干扰物质导致的假阴性防止检测结果出现假阴性、监控反应体系是否有效，本专利技术的试剂组合可额外提供有内标监控系统。具体地，所述内标监控系统可包括内标模板、内标上游引物、内标下游引物和内标探针。在一个具体的实施方式中内标模板为为插入pUC18T载体的一段长为110碱基对的人工合成DNA序列的重组体，浓度为5.00E+03拷贝/ml～5.00E+05拷贝/ml，序列如下所示：5’-ACCGAAAGGCTATCATTATGGCTCCAGTTCCTCGTTAATTCTCGATTCCGAGTACTTTAAAGGGGCTTCTGGTCGACTACGTACGCTCTCTTCTACTTCGAGTACGACAG-3’(SEQIDNo.4)；内标上游引物为IC-F：5’-ACCGAAAGGCTATCATT-3’(SEQIDNo.5)；内标下游引物为IC-R：5’-CTGTCGTACTCGAAGTA-3’(SEQIDNo.6)；和内标探针为IC-P：5’-GGCTCCAGTTCCTCGTTAATT-3’(SEQIDNo.7)。在具体的实施方式中，内标上游引物与内标下游引物可分别以0.1μmol/L～0.4μmol/L的浓度存在；内标探针可以0.1μmol/L～0.4μmol/L的浓度存在。类似地，所述内标探针的两端可分别标记有报告荧光基团和淬灭荧光基团。示例性的报告荧光基团可以是CY5、CalRed610、FAM、HEX、JOE、ROX、TET、TEXASRED和VIC等。示例性的荧光淬灭基团可以是BHQ1、BHQ2、BHQ3、Eclipse、TAMRA等。优选的，所述内标探针与检测把多核苷酸的探针具有不同的报告荧光基团。优选的，所述内标探针与检测把多核苷酸的探针具有相同的报告荧光基团。在优选的实施方式中，内标探针的报告荧光基团可为HEX，内标探针的荧光淬灭基团可为BHQ1。在一些实施方式中，本专利技术的试剂组合还可包括用于从样本中提取和/或纯化柯萨奇病毒A4型RNA的试剂。示例性的提取或纯化方法可包括煮沸法、离心柱法、磁珠法。在优选的实施方式中，本专利技术的试剂组合包括使用磁珠法提取或纯化RNA的相本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种试剂组合，其用于与柯萨奇病毒A4型的检测相关的用途，所述试剂组合包括：上游引物：5'‑ACATCCACCATACAGAGGGTCA‑3'；下游引物：5'‑GCTGTAGACGAAGCTCCT‑3'；和探针：5'‑CAACAGCCGCCAACACCAC‑3'。

【技术特征摘要】
1.一种试剂组合，其用于与柯萨奇病毒A4型的检测相关的用途，所述试剂组合包括：上游引物：5'-ACATCCACCATACAGAGGGTCA-3'；下游引物：5'-GCTGTAGACGAAGCTCCT-3'；和探针：5'-CAACAGCCGCCAACACCAC-3'。2.根据权利要求1所述的试剂组合，所述试剂组合用于柯萨奇病毒A4型的荧光定量PCR检测。3.根据权利要求1或2所述的试剂组合，所述探针的两端分别标记有报告荧光基团和淬灭荧光基团。4.根据权利要求3所述的试剂组合，所述报告荧光基团选自由CY5、CalRed610、FAM、HEX、JOE、ROX、TET、TEXASRED和VIC组成的组，优选为FAM；所述淬灭荧光基团选自由BHQ1、BHQ2、BHQ3、Eclipse和TAMRA组成的组，优选为BHQ1。5.根据权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄河，易晓明，王铁军，易丽媛，邓中平，刘佳，戴立忠，
申请(专利权)人：湖南圣湘生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43