一种提取太岁组织中细菌DNA的材料前处理方法技术

本发明专利技术提供了一种提取太岁组织中细菌DNA的材料前处理方法，包括以下步骤：a、测定太岁组织的溶解温度；b、将若干太岁组织切块加入到水中，并置于水浴锅中，在溶解温度下保温，使太岁组织切块在10min内溶解，从而得到太岁组织溶解液；c、使用一次性针头滤器过滤步骤b所得的太岁组织溶解液，使太岁组织溶解液中的细菌菌体富集在滤膜上；d、取出步骤c的滤膜并切碎，然后按照常规细菌DNA提取方法提取DNA。本发明专利技术能够使太岁组织彻底分散，同时通过物理去除多糖类物质，避免了DNA提取过程中多糖类物质的干扰，适用于在热水中能够溶解的太岁。

A Material Pretreatment Method for Extracting Bacterial DNA from Too-old Tissues

【技术实现步骤摘要】
一种提取太岁组织中细菌DNA的材料前处理方法
本专利技术涉及生物
，具体地说涉及一种提取太岁组织中细菌DNA的材料前处理方法。
技术介绍
太岁是一种在中国古籍中有记载，现代又不断被发现的神秘物体。该类物体形态各异，但大体呈圆形，共同特征是高度组织化，有韧性不易撕裂，质感如肉似胶，有的在外部具耳片状和蜂窝状褶皱，有的在内部具明显的纤维状纹理，此二特征均非化工胶体脱模所能仿制，另外，大部分太岁还能遇开水即溶化。从1992年陕西渭河的首例太岁报道至今，学术界一直在研究其形成之谜。化学分析表明，太岁中含有核酸（2.053～35.1286μg/g）、蛋白质（20.35～184.18mg/g）、多糖（8.97～46.57mg/g）等生物体中最基本的要素；主体物质是聚乙烯醇（70%），但并不能排除其生物成因可能性。由于其多发现于土层中，不含光合色素，故倾向于认为是一种菌类，并试图通过研究其菌类构成，以确定其生物学分类地位。培养方法是获得菌类纯种的经典方法，在做太岁组织浸提液常规涂板培养时，出现数量最多的菌类是细菌，并且其种类会随着培养基配方、pH值和氧气条件的不同而变化，提示太岁中包含有多种细菌，也不排除还有大量的不可培养类型。因此，要通过该方法获得太岁中细菌的全部信息既工作量浩繁，又近乎不可能。基于此，非培养方法，如16SrDNA克隆文库、末端限制性片段长度多态性分析(T-RFLP)、16SrDNA高通量等方法，逐渐被用来研究太岁中细菌的菌群结构。但测定的结果，除再次表明太岁细菌种类丰富外，在不同太岁间并没有获得高占比共有优势属，甚至在产地、形态相同的两个太岁间亦未有，其中，一个是盐单胞菌属（Halomonas24.71%），另一个是芽孢杆菌属（Bacillus17．60％）。不同测试结果间的巨大差别，根源实际上是分析用DNA间的差别。这些测试所用DNA，其提取方法的一个共同点都是把太岁组织进行了简单的研磨处理。这种材料处理方法存在一个明显缺陷，即没有根据太岁材料特性做针对性改变，表现在两个方面：一是组织未被真正破碎，所谓研磨烂的太岁组织，在DNA提取过程中会重新粘结成团，团内的菌体不能与裂解液接触被裂解，即太岁中各种细菌释放基因的机会是不同的，所以，提取到的DNA不能真实代表细菌的全部信息；二是太岁中的多糖、聚乙烯醇为主的多羟基类物质（均呈多糖反应，文中统称为多糖类物质），会溶解到裂解液中，提高了液体的粘滞性，DNA分子极难游离出来，形成了培养时出菌很多，却提取不到DNA或产量极低的奇怪现象，同样也干扰了细菌信息的正确获取。综上可知，由于目前缺乏适合太岁材料特性的组织处理方法和降低多糖类物质干扰的方法，提取不到能真实代表太岁中细菌信息的DNA，因而制约了太岁分子生物学研究的进程。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种提取太岁组织中细菌DNA的材料前处理方法，以解决现有技术提取不到能真实代表太岁中细菌信息的DNA的问题。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种提取太岁组织中细菌DNA的材料前处理方法，包括以下步骤：a、将若干太岁组织切块1加入到水中，并置于温度可调的水浴锅中；b、梯度升高水浴锅的温度，测出在水浴10min时，能够使太岁组织切块1完全软化成泥并溶解的温度；c、将太岁组织切分成比太岁组织切块1粒度更小的太岁组织切块2，将若干太岁组织切块2加入到水中，并置于水浴锅中，在溶解温度下保温，使太岁组织切块2在10min内溶解，从而得到太岁组织溶解液；d、使用一次性针头滤器过滤步骤c所得的太岁组织溶解液，使太岁组织溶解液中的细菌菌体富集在滤膜上，然后用预热到溶解温度的热水冲洗滤膜，减少多糖类物质的残留；e、取出步骤d的滤膜并切碎，然后按照常规细菌DNA提取方法提取DNA。步骤a中，太岁组织切块1为肉眼能够观察到其在水中相态变化的组织切块。温度可调的水浴锅应有小于等于0.5℃的精确度，并有温度数显功能。步骤c中，水的量应能淹没太岁组织切块2，并与后续一次性针头滤器的容积等量，此时，在太岁组织重量不变情况下，溶液浓度最低，便于过滤。步骤d中，经单个滤器过滤的太岁组织溶解液中溶解的太岁组织量≤滤器对该太岁组织的最大滤过量。步骤d中，一次性针头滤器的滤膜孔径为0.22µm；细菌菌体不能通过该滤膜。一次性针头滤器为用注射器推压过滤的滤器，滤膜封装在里面，已经灭菌，用一次即丢弃。步骤e中，提取细菌DNA时，加入溶菌酶，以同时获得革兰氏阳性、革兰氏阴性细菌DNA。步骤e中，取出滤膜时，先缓慢将滤器中压住滤膜的塑料封边去除。步骤e中，用≧0.6克太岁组织提取的DNA就可用细菌通用引物扩增检测到。一次性针头滤器有不同的直径规格，规格不同，微孔数量不同，过滤物质的量会不同，在实际操作过程中需要进行测定，用足其过滤能力，尽可能增加单次过滤富集的菌量。选定一次性针头滤器的规格后，需测定其最大滤过量，过程为梯度增加太岁组织切块的重量，在溶解温度下，用与一次性针头滤器的容积等量的蒸馏水振荡溶解并过滤，通过观察其能否顺利过滤完全，以能够顺利过滤完全的最大太岁组织重量表示最大滤过量。在制备太岁组织溶解液时，单次过滤对应的太岁组织重量应不超过其最大滤过量，此时的切块要远小于测定溶解温度时的切块大小。试管入水浴前后要振荡，以避免溶化的太岁粘壁，溶化用水浴时间在10min以内，尽量减少对菌体的破坏。确定太岁的溶解温度后，需检测该温度对细菌的破坏力，确认方法是采用细菌通用引物对滤液进行扩增的方法，检查通过滤器的滤液中是否含有细菌DNA。太岁取样重≥0.6克时，其提取物就可用通用引物扩增的方法检测到含有细菌DNA。由于扩增所需DNA浓度低于琼脂糖凝胶电泳显示DNA条带所需的浓度，故当用琼脂糖凝胶电泳检测提取物未出现DNA条带时，表明DNA浓度偏低，可用增加滤膜数量的方法解决，即加大在原滤膜用样品取样处的取样量，按原滤膜选用的滤过量，将样品分成多份，分别制成溶解液过滤，获得的多份滤膜合在一起提取DNA。本专利技术操作简单，通过预先测定太岁组织的溶解温度，能够使太岁组织彻底分散，同时通过物理去除多糖类物质，避免了DNA提取过程中多糖类物质的干扰，适用于在热水中能够溶解的太岁。应用本专利技术，可以获得包含太岁中细菌全部信息的DNA，为探讨其真实的细菌群落结构和开展其它分子生物学研究奠定基础。附图说明图1是本专利技术测定溶解温度对细菌破坏力的扩增产物凝胶电泳结果图，图中，M：Marker；1：阴性对照；2–4：溶解液；5–7：滤液。图2是本专利技术细菌DNA提取效果检测的扩增产物凝胶电泳结果图，图中，M：Marker；1：阴性对照；2：DNA提取物。图3是本专利技术革兰氏阳性细菌DNA提取效果检测的扩增产物凝胶电泳结果图，图中，M：Marker；1：阴性对照；2：阳性对照；3：DNA提取物。图4是本专利技术细菌DNA提取物的凝胶电泳结果图，图中，M：Marker；1：DNA提取物。具体实施方式下面以收集于河南省三门峡市的一个太岁为例，对本专利技术做进一步详细叙述。该太岁形状似尖圆柱体，重量约20千克，手感如硬橡皮，外表呈红褐色，内部组织浅红渐变至白色，尖端部分外表有明显的蜂窝状褶皱。在前期采用涂板方法分离其中所含细菌时，平皿上多次多点出现具相同形态的放线菌菌落，经纯化获得本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提取太岁组织中细菌DNA的材料前处理方法，其特征是，包括以下步骤：a、将若干太岁组织切块1加入到水中，并置于温度可调的水浴锅中；b、梯度升高水浴锅的温度，测出在水浴10 min时，能够使太岁组织切块1完全软化成泥并溶解的温度；c、将太岁组织切分成比太岁组织切块1粒度更小的太岁组织切块2，将若干太岁组织切块2加入到水中，并置于水浴锅中，在溶解温度下保温，使太岁组织切块2在10 min内溶解，从而得到太岁组织溶解液；d、使用一次性针头滤器过滤步骤c所得的太岁组织溶解液，使太岁组织溶解液中的细菌菌体富集在滤膜上，然后用预热到溶解温度的热水冲洗滤膜，减少多糖类物质的残留；e、取出步骤d的滤膜并切碎，然后按照常规细菌DNA提取方法提取DNA。

【技术特征摘要】
1.一种提取太岁组织中细菌DNA的材料前处理方法，其特征是，包括以下步骤：a、将若干太岁组织切块1加入到水中，并置于温度可调的水浴锅中；b、梯度升高水浴锅的温度，测出在水浴10min时，能够使太岁组织切块1完全软化成泥并溶解的温度；c、将太岁组织切分成比太岁组织切块1粒度更小的太岁组织切块2，将若干太岁组织切块2加入到水中，并置于水浴锅中，在溶解温度下保温，使太岁组织切块2在10min内溶解，从而得到太岁组织溶解液；d、使用一次性针头滤器过滤步骤c所得的太岁组织溶解液，使太岁组织溶解液中的细菌菌体富集在滤膜上，然后用预热到溶解温度的热水冲洗滤膜，减少多糖类物质的残留；e、取出步骤d的滤膜并切碎，然后按照常规细菌DNA提取方法提取DNA。2.根据权利要求1所述的提取太岁组织中细菌DNA的材料前处理方法，其特征是，步骤a中，太岁组织切块1为肉眼能够观察到其...

【专利技术属性】
技术研发人员：王朝江，
申请(专利权)人：河北省农林科学院遗传生理研究所河北省农林科学院农产品质量安全研究中心，
类型：发明
国别省市：河北,13