一株高效生产类胡萝卜素的扇贝短波单胞菌及其培养方法与应用技术

本发明专利技术提供从海水双壳贝类——华贵栉孔扇贝肠道内分离的一株能够生产类胡萝卜素的细菌，其分类命名为扇贝短波单胞菌(Brevundimonas scallop Zheng&Liu)，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO:M2019023。该菌具有极强地适应寡营养环境和高效地生产类胡萝卜素的特征。本发明专利技术还涉及一种扇贝短波单胞菌的培养方法，具体为普通LB培养基在PH值7～9、接种量0.05～0.5％、摇床转速100～200r/min、20～30℃条件下培养3～5天，可生产出3.92mg/L～4.56mg/L的类胡萝卜素，并且在提取类胡萝卜素过程中无需对细胞进行破壁及干燥处理。本发明专利技术具有生产效率高、成本低、操作简单等优点。

An efficient carotenoid-producing strain of Shortwave Bacillus scallop and its culture method and Application

【技术实现步骤摘要】
一株高效生产类胡萝卜素的扇贝短波单胞菌及其培养方法与应用
本专利技术属于海洋细菌及其培养与应用领域，尤其涉及一株高效生产类胡萝卜素的扇贝短波单胞菌及其培养方法与应用。
技术介绍
类胡萝卜素(Carotenoids)是一类天然存在于自然界中的脂溶性色素，属于萜类化合物，含有一系列的甲基支链和共轭双键，因其甲基、共轭双键的数目和取代基的属性而呈现不同的颜色特征。自从19世纪对类胡萝卜素开始研究，已经发现将近1000多种类胡萝卜素，它们都具有多种多样的生物学功能。人类和动物都不能自身合成类胡萝卜素，主要通过食物摄取吸收。自然界的类胡萝卜素主要是由植物和微生物(微藻，细菌和真菌)合成。类胡萝卜素因其抗氧化的特性而具有许多有益的生物活性和药用价值，比如清除氧化自由基、延缓衰老、防癌抗癌、增强机体免疫等。类胡萝卜素存在着巨大的市场前景。近年来，类胡萝卜素在医学、食品、保健等方面的应用越来越多，并且作为食品添加剂和营养品，已得到FDA和WHO等国际组织的认可。目前，市场上消费的类胡萝卜素主要有β-胡萝卜素、叶黄素、虾青素和番茄红素。仅虾青素在美国的消费量，预计2020年就可以达到670吨，价值11亿美元。类胡萝卜素的生产方法主要分为植物(高等植物和藻类)提取和微生物发酵的方法。其中典型植物提取法主要包括：胡萝卜(Daucuscarota)用于提取β-胡萝卜素；万寿菊(Tageteserecta)用于提取叶黄素；番茄(Solanumlycopersicum)用于提取番茄红素。国外已被批准用于商业生产类胡萝卜素的藻类有杜氏藻和红球藻。另外，三孢布拉氏霉(Blakesleatrispora)在pH值为11的条件下培养4天，可以44.5mg/gβ-胡萝卜素。一株优化的法夫酵母(Xanthophyllomycesdendrorhous)突变株可以产生9.7mg/g虾青素。细菌生产类胡萝卜素的相关工作主要集中在天然类胡萝卜素的生产菌(光合和非光合细菌)和基因工程大肠杆菌的研究。研究较多的生产类胡萝卜素的光合细菌主要有:着色细菌属(Chromatium)、红球菌属(Rhodopila)、红杆菌属(Rhodobacter)、红微菌属(Rhodomicrobiun)等，非光合细菌主要有副球菌(paracoccus)、黄杆菌(Flavobacteriumsp.)、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)、短波单胞菌(Brevundimonas)等，但这些细菌生产类胡萝卜素的效率较低，干重菌体中的类胡萝卜素含量一般在0.1～1.2mg/g。相比于真菌和微藻，目前能够易于培养和繁殖用于生产类胡萝卜素的细菌还非常少。许多海洋动物，特别是海洋无脊椎动物的体内富含类胡萝卜素，一方面它们通过摄食积累类胡萝卜素，另一方面它们也可以通过体内的共生菌生产类胡萝卜素。然而，迄今为止，从海洋动物体内分离能够生产类胡萝卜素的细菌还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一株高效生产类胡萝卜素的扇贝短波单胞菌及其培养方法与应用，以解决现有技术存在的问题。本专利技术从一种海洋双壳贝类——华贵栉孔扇贝的肠道内分离、鉴定并已能够稳定培养、且能够极强地适应寡营养环境和具有高效生产天然类胡萝卜素特征的细菌，属于短波单胞菌属Brevundimonas，命名为扇贝短波单胞菌(BrevundimonasscallopZheng&Liu501)，并且保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉大学，保藏日期为2019年1月7日，菌种保藏号为CCTCCNO:M2019023。上述高效生产类胡萝卜素的扇贝短波单胞菌的培养方法，所述培养方法为将所述扇贝短波单胞菌接种到初始pH为7～9的培养基中，接种量为0.05～0.5％，摇床转速为100～200r/min，20～30℃培养3～5天。得到发酵液，从所述发酵液中提取类胡萝卜素。培养方法简单、廉价。优选的，所述培养基为LB培养基，包括以下重量百分含量组分：酵母提取物0.5％，蛋白胨1％，氯化钠1％，其余为水。本专利技术的菌需要的培养基成分比较简单，为通用的LB培养基，不需要额外添加氮源、碳源等营养物质。其他生产类胡萝卜素的菌在培养过程中多数会添加葡萄糖、果糖、半乳糖等碳源。上述高效生产类胡萝卜素的扇贝短波单胞菌的应用，利用培养基高效生产类胡萝卜素。可生产出1.40-1.52mg/g的类胡萝卜素。发酵液中的细菌细胞无需破壁处理和冷冻干燥，直接离心去上清液，进行有机溶剂提取，获得类胡萝卜素。优选的，所述培养基为LB培养基。扇贝短波单胞菌的分离：随机挑选华贵栉孔扇贝金色个体，解剖扇贝取肠道、匀浆、稀释，然后进行无菌培养。将橙色和红色的菌落挑出，进行纯化和后续的鉴定。扇贝短波单胞菌的鉴定：通过克隆及测定该菌种的16SrDNA序列，并进行进化分析，结果表明该菌种与BrevundimonasvesicularisstrainFDAARGOS的16SrDNA序列同源性为99％，与Brevundimonasvesicularisstrain266XY4的16SrDNA序列同源性为98％。该菌落呈现橘红色、圆形、凸起、表面光滑、边缘整齐、有粘性。电镜观察细菌形态为长杆状，大小为1～5μm。基因组测序结果表明其存在合成类胡萝卜素(虾青素)所有关键酶的基因。扇贝短波单胞菌培养条件的优化：分别配制四种不同营养成分的液体培养基，接种相同含量的细菌用于后续培养，培养条件为培养条件为25℃，150rpm。每12小时检测发酵液的OD600值，测定及比较四种培养状态下扇贝短波单胞菌的生长率。扇贝短波单胞菌生产类胡萝卜素的效率：在相同培养条件，在四种培养基中接种等量的扇贝短波单胞菌，进行发酵3天，将发酵液2000rpm离心10min，弃上清液，所得菌体加丙酮进行提取类胡萝卜素，并进行类胡萝卜素含量的测定和比较。现有利用细菌生产天然类胡萝卜素的方法通常采用基因工程技术的细菌，需要30～37℃和200～220rpm的培养条件、5天的培养时间、提取类胡萝卜素的方法复杂，需要对菌体进行破碎和干燥处理，生产效率0.1～1.2mg/g。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：1.本专利技术分离的扇贝短波单胞菌来自于海洋贝类，与宿主共生，对宿主无害，没有采用基因工程技术。因此，生态环保。2.本专利技术分离的扇贝短波单胞菌具有寡营养特性，在室温25℃条件下，采用普通LB培养基就可以生产类胡萝卜素；并且提取类胡萝卜素生产中无需对细胞进行破壁及干燥处理。扇贝短波单胞菌中的类胡萝卜素可以用有机溶剂直接萃取，其他报道的类胡萝卜素生产菌多数在萃取前都需要进行破壁和干燥处理。因此，成本低、操作简单、易推广。3.本专利技术分离的扇贝短波单胞菌只需要3天就能够生产1.40-1.52mg/g的类胡萝卜素。因此，生产效率高。附图说明图1为本专利技术的扇贝短波单胞菌BrevundimonasscallopZheng&Liu501的扫描电镜照片。图2为本专利技术的扇贝短波单胞菌的16srRNA系统进化树。图3为扇贝短波单胞菌的类胡萝卜素合成通路图。图4为不同发酵条件下扇贝短波单胞菌的生长曲线图。图5为不同发酵条件下扇贝短波单胞菌的类胡萝卜素产量。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株高效生产类胡萝卜素的扇贝短波单胞菌(Brevundimonas scallop Zheng&Liu 501)，其特征在于，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO:M2019023。

【技术特征摘要】
1.一株高效生产类胡萝卜素的扇贝短波单胞菌(BrevundimonasscallopZheng&Liu501)，其特征在于，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCCNO:M2019023。2.根据权利要求1所述高效生产类胡萝卜素的扇贝短波单胞菌的培养方法，其特征在于，所述培养方法为将所述扇贝短波单胞菌接种到初始pH为7～9的培养基中，接种量为0.05～0.5％...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑怀平，刘宏星，江胜，
申请(专利权)人：汕头大学，
类型：发明
国别省市：广东,44