新型乳酸菌抗菌肽及高效表达及抗菌抗癌活性的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种新型乳酸菌抗菌肽及高效表达及抗菌抗癌活性的应用，通过分析干酪乳杆菌(L.casei HZ1)的基因图谱，得到抗菌肽LHH1的基因序列，如序列1所示，模拟其二级结构，确定该肽的主要理化性质。依照乳酸菌密码子偏爱性优化并全合成LHH1基因，将该基因片段克隆到乳酸菌表达载体pE‑SUMO中，构建得到pE‑SUMO‑EA‑LHH1重组质粒。将重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)pLysS中，对其进行诱导表达并分离纯化。本方法所获得的抗菌肽LHH1热稳定性强，有良好的抗菌、抗癌效果，可作为优良的防腐添加剂及发酵剂用于食品、药品、饲料等行业中。

Novel Antimicrobial Peptides from Lactobacillus and Their High Level Expression and Application in Antimicrobial and Anticancer Activities

【技术实现步骤摘要】
新型乳酸菌抗菌肽及高效表达及抗菌抗癌活性的应用
本专利技术涉及基因工程和生物
，尤其是涉及一种新型乳酸菌抗菌肽LHH1的高效表达及抗菌抗癌活性的应用。
技术介绍
自上世纪90年代以来，对抗菌肽等新型抗菌物质的研究日益增加，其中防御素、富组蛋白(Histatin)等抗菌活性肽家族是人体免疫系统的天然成分，具有抗菌活性强、毒副作用小，耐药菌株少等优点，备受关注。抗菌肽在机体受到病毒、细菌等攻击时会被诱导产生，是动、植物和人类先天性免疫机制的组成部分，具有广谱抗菌作用，尤其对一些产生抗生素耐药性的病原菌，故而在农业、医疗、食品等多个领域应用潜力很大。乳酸菌是一类以糖为原料产生乳酸的细菌，具有提高食品营养价值、改善食品风味、延长保存时间、对人畜安全无害，有保健功能的益生菌，因此被视为理想的蛋白多肽类物质的口服载体与表达载体。目前为止，已发现上千种天然抗菌肽，但其来源较复杂，安全指数待考究，因此，人们希望能从益生菌内探寻相关的抗菌肽，以保证其使用的安全性。人们为了得到抗菌肽主要采用了三种方法：1.直接从生物体中提取天然肽；2.化学方法合成；3.采用基因工程的方法。前两种由于成本过高，不适用于大规模生产，基因工程表达的方法越来越被大家所认可。先构建高效表达的发酵菌株，并建立其纯化和发酵的条件和方法，以便抗菌肽的生产推广和其在多方面的应用。
技术实现思路
本专利技术通过基因工程技术表达了一种来自干酪乳杆菌的新型抗菌肽LHH1，得到其高效表达的发酵菌株，并证实了LHH1的抗菌抗癌活性，以及在不同温度下LHH1的稳定性。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是：一种新型乳酸菌抗菌肽，核苷酸序列见SEQIDNO.1所示。而且，所述抗菌肽的氨基酸序列、分子量、电荷数、等电点、疏水性分别为：AFALIAGALYRIFHRR，1875.25，+3，11.71，0.98。一种新型乳酸菌抗菌肽的表达方法，其特征在于：包括以下步骤：S1.合成权利要求1所述的氨基酸序列，该序列为新型乳酸菌抗菌肽基因；S2.构建含抗菌肽重组大肠杆菌基因工程菌；S3.抗菌肽融合蛋白的诱导表达；S4.抗菌肽的纯化。而且，所述S1过程包括：根据干酪乳杆菌基因GenBank：(MOAG00000000.1)并应用生物信息学工具计算各组合的一级特征参数、预测二级和抗菌活性，设计出具有医疗潜力的抗菌肽LHH1；根据大肠杆菌对密码子的偏爱性将抗菌肽的基因序列翻译成核酸序列，在其两端加上BsaI和HindIII限制性内切酶位点和保护性碱基，合成引物F1、R1应用，所述引物的核苷酸序列如下SEQIDNO.2和SEQIDNO.3。而且，所述S2过程包括：构建抗菌肽表达质粒pE-SUMO-LHH1并测序鉴定，构建基因工程菌株pE-SUMO-EA-LHH1/Rosetta(DE3)pLysS并测序鉴定，所述测序鉴定SEQIDNO.4，测序结果使用NCBIBlast与所设计的基因进行对比，选取两者结果一致的重组菌为测序结果正确的重组菌。而且，所述S3过程中包括：将步骤S2中测序结果正确的重组菌和含有空载体的对照菌进行平板培养、种子培养，将发酵液中菌体生长到对数期后分别加入IPTG诱导表达，然后进行SDS-PAGE分析和HPLC分析，选取表达成功的抗菌肽。而且，所述S4过程包括：将基因工程菌pE-SUMO-EA-LHH1/Rosetta(DE3)pLysS大量培养、诱导，收集菌体并获得融合蛋白，进行亲和层析纯化，纯化后的融合蛋白经肠激酶切割去除标签，然后进行定量，纯化样品保留。新型乳酸菌抗菌肽作为制备抗癌制剂的应用。新型乳酸菌抗菌肽作为制备抗菌制剂的应用。本专利技术的有益效果为：本专利技术表达了一种来自干酪乳杆菌的新型抗菌肽LHH1，得到其高效表达的发酵菌株，并证实了LHH1的抗菌抗癌活性，以及在不同温度下LHH1的稳定性。本专利技术所获得的重组大肠杆菌可以高效表达LHH1，其菌体裂解物对金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)等革兰阳性细菌具有较强的抑菌活性，对酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等真菌也具有一定的抑菌活性，且即使在100℃处理下的LHH1，仍保持着较强的抑菌能力。将纯化后的抗菌肽加入铺在96孔板培养的癌细胞中，可以显著抑制癌细胞的增值。本专利技术方法不仅在乳酸菌中分析发现了一种新型抗菌肽LHH1，还为其提供了基因工程表达的方法，而且所获得的LHH1稳定性强，具有较好的抗菌抗癌活性，可作为优良的防腐添加剂及发酵剂用于食品、药品、饲料等行业中。附图说明图1为干酪乳杆菌的基因图谱图；图2为抗菌肽LHH1的二级结构模拟图；图3为抗菌肽LHH1的表达质粒pE-SUMO-EA-LHH1的构建过程示意图以及重组表达载体的质粒的PCR鉴定。图4为抗菌肽LHH1表达产物的SDS-PAGE分析。图5为抗菌肽LHH1高效液相色谱图，上图为酶切后的LHH1，用于确定其结构正确，下图为纯化后的LHH1。图6为纯化后的LHH1的Tricine-SDS-PAGE分析。其中泳道1为单独表达的SUMO标签蛋白，泳道2为未纯化的融合蛋白——SUMO标签蛋白+抗菌肽LHH1，泳道3为纯化后的融合蛋白，泳道4为肠激酶酶切后的融合蛋白，泳道5为高效液相色谱纯化后的融合蛋白。图7为抗菌肽LHH1的质谱分析图。图8为对表达的抗菌肽LHH1抑制金黄色葡萄球菌检定，1为表达纯化的LHH1；2为表达纯化后的SUMO-LHH1；3为表达纯化后的SUMO蛋白。图9为抗菌肽LHH1对癌细胞的MTT检测。图10为不同温度处理的抗菌肽抑菌活性，1为40℃，2为60℃，3为80℃，4为100℃，C为对照组——没有经过加热处理过的抗菌肽。图11是大量抑菌实验汇总得到的抗菌肽LHH1的抑菌谱。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术进一步说明，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本专利技术的保护范围。本专利技术提供一种新型乳酸菌抗菌肽LHH1的高效表达及抗菌抗癌活性的应用。具体内容包括：依照大肠杆菌密码子偏爱性优化LHH1基因，通过PCR扩增得到优化后的LHH1基因，将该基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pESUMO中，构建得到pESUMO-LHH1重组质粒。将重组质粒转化到Rosetta(DE3)PlysS中，经SDS-PAGE检测确定LHH1的表达水平，经琼脂孔扩散法和细胞MTT法检测抗菌及抗癌活性。另外，为检测抗菌肽LHH1的热稳定性，对其用不同温度处理后，再测试其抑菌活性。结果显示：本专利技术所获得的重组大肠杆菌可以高效表达LHH1，其菌体裂解物对金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)等革兰阳性细菌具有较强的抑菌活性，对酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等真菌也具有一定的抑菌活性，且即使在100℃处理下的LHH1，仍保持着较强的抑菌能力。将纯化后的抗菌肽加入铺在96孔板培养的癌细胞中，可以显著抑制癌细胞的增值。本专利技术方法不仅在乳酸菌中分析发现了一种新型抗菌肽LHH1，还为其提供了基因工程表达的方法，而且所获得的LHH1稳定性强，具有较好的抗菌抗癌活性，可作为优良的防腐添加剂及发酵剂用于食品、药品、饲料等行业中。实施例1一种新型乳酸菌抗菌肽LHH1的制备，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新型乳酸菌抗菌肽，其特征在于：核苷酸序列见SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种新型乳酸菌抗菌肽，其特征在于：核苷酸序列见SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的新型乳酸菌抗菌肽，其特征在于：所述抗菌肽的氨基酸序列、分子量、电荷数、等电点、疏水性分别为：AFALIAGALYRIFHRR，1875.25，+3，11.71，0.98。3.一种权利要求1所述的新型乳酸菌抗菌肽的表达方法，其特征在于：包括以下步骤：S1.合成权利要求1所述的氨基酸序列，该序列为新型乳酸菌抗菌肽基因；S2.构建含抗菌肽重组大肠杆菌基因工程菌；S3.抗菌肽融合蛋白的诱导表达；S4.抗菌肽的纯化。4.根据权利要求3所述的新型乳酸菌抗菌肽的表达方法，其特征在于：所述S1过程包括：根据干酪乳杆菌基因GenBank：(MOAG00000000.1)并应用生物信息学工具计算各组合的一级特征参数、预测二级和抗菌活性，设计出具有医疗潜力的抗菌肽LHH1；根据大肠杆菌对密码子的偏爱性将抗菌肽的基因序列翻译成核酸序列，在其两端加上BsaI和HindIII限制性内切酶位点和保护性碱基，合成引物F1、R1应用，所述引物的核苷酸序列如下SEQIDNO.2和SEQIDNO.3。5.根据权利要求3所述的新型乳酸菌抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗学刚，贺军芳，金杜欣，俞晓亭，张同存，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津,12