一种细胞规模化培养方法、纯化方法及细胞信使技术

本发明专利技术提供了一种细胞的规模化培养方法，包括：将待培养细胞与灭菌后的GE微载体接种于含血清的培养基，在生物培养器中培养至高密度，然后换成无血清培养基，在无血清培养基中继续培养4‑7d，收集上清液即可。该培养方法操作简单，操作条件比较温和，细胞成活率高，为后续细胞规模化的培养提供了参照方法，值得广泛推广应用。

A Method of Cell Scale Culture, Purification and Cell Messenger

【技术实现步骤摘要】
一种细胞规模化培养方法、纯化方法及细胞信使
本专利技术涉及细胞培养领域，具体而言，涉及一种细胞规模化培养方法、细胞信使及纯化方法。
技术介绍
每个成人体内，大约含有300亿个白色脂肪，功能是将能量以脂肪细胞的形式储存起来。每个脂肪细胞中，都含有三酸甘油脂，俗称脂肪球。脂肪球量变大，脂肪细胞体积就扩增，造成肥胖；反之燃烧三酸甘油脂，细胞萎缩身材就瘦下来了。在正常情形下，脂肪细胞数目到了青春期后就不再增加。身体脂肪的分布，部分取决于遗传及荷尔蒙等影响，例如女性的皮下脂肪多积聚于小腹、臀部及大腿，而男性则囤积于上腹及腰部。脐带间充质细胞(MesenchymalStemCells，MSCs)是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应用前景。应用灭活脐带血清培养体系可成功扩增人脐带间充质干细胞，培养的细胞具有间充质干细胞的基本特性，为建立间充质干细胞库和临床应用提供了理论依据。微载体指直径在60-250μm，能适用于贴壁细胞生长的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。微载体应用的原理是将对细胞无害的颗粒-微载体加入到培养容器的培养液中，作为载体使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。贴壁依赖性细胞在微载体表面上的增殖，要经历黏附贴壁、生长和扩展成单层三个阶段。细胞只有贴附在固体基质表面才能增殖，故细胞在微载体表面的贴附是进一步铺展和生长的关键。黏附主要是靠静电引力和范德华力。细胞能否在微载体表面黏附，主要取决于细胞与微载体的接触概率和相融性。现有技术中的微载体培养细胞的方法工艺复杂，操作条件苛刻，细胞成活率不高，接种密度低，而且对微载体本身的要求高，需要采用专用型的微载体才能保证细胞培养的正常进行，间接提高了操作成本，限制了微载体的应用面。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种细胞规模化的培养方法，上述培养方法操作简单，操作条件比较温和，细胞成活率高，为后续细胞规模化的培养提供了可供参照的方法，值得广泛推广应用。本专利技术的第二目的在于提供一种细胞特定的纯化方法，纯化后为天然非重组结构特性，纯度高，且其模拟体内的最适比例浓度协同作用，调控细胞增殖、分化、维持组织和细胞有序生长发育，胶原蛋白、纤连蛋白、超氧化物歧化酶等蛋白质是维持肌肤年轻态的关键成分，纯化得到产物应用非常广泛。本专利技术的第三目的在于提供上述培养方法得到的细胞信使，通过采用本专利技术的培养方法获得的细胞信使不仅活性好，培养获得的每种类型的细胞信使功能性均比较强，而且该方法本身操作简单，操作条件比较温和，细胞成活率高，为后续细胞规模化的培养提供了可供参照的方法，值得广泛推广应用。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：本专利技术提供了一种细胞规模化的培养方法，包括如下步骤：将待培养细胞与灭菌后的GE微载体接种于含血清的培养基，在生物培养器中培养至高密度，然后换成无血清培养基，在无血清培养基中继续培养4-7d，收集上清液即可。所述待培养细胞为脐带间充质细胞、脂肪细胞中的一种或两种；优选地，所述待培养细胞的接种密度为(8-9)*103cell/ml；更优选地，所述待培养细胞的接种密度为8.6*103cell/ml。微载体指直径在60-250μm，能适用于贴壁细胞生长的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。微载体应用的原理是将对细胞无害的颗粒-微载体加入到培养容器的培养液中，作为载体使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。贴壁依赖性细胞在微载体表面上的增殖，要经历黏附贴壁、生长和扩展成单层三个阶段。细胞只有贴附在固体基质表面才能增殖，故细胞在微载体表面的贴附是进一步铺展和生长的关键。黏附主要是靠静电引力和范德华力。细胞能否在微载体表面黏附，主要取决于细胞与微载体的接触概率和相融性。现有技术中的微载体培养细胞的方法工艺复杂，操作条件苛刻，细胞成活率不高，接种密度低，而且对微载体本身的要求高，需要采用专用型的微载体才能保证细胞培养的正常进行，间接提高了操作成本，限制了微载体的应用面。本专利技术为了解决上述技术问题，提供了一种细胞规模化的培养方法，该培养方法操作简单，操作条件温和，通过不断探索摸索出并建立最佳比例条件，以将微载体结合待培养细胞进行规模化培养的方式，细胞成活率有保证，接种密度高，对微载体本身的要求低，并不需要配备专用的微载体，降低了操作成本，简化了培养方式，值得广泛推广应用。优选地，接种后所形成的的培养液的总浓度为0.1-1wt％之间。更优选地，，将细胞接种后，对微载体与待培养细胞在培养基中的总浓度进行测定，最适宜的浓度需要控制在0.2-0.8wt％之间，还可以为0.3wt％、0.4wt％、0.6wt％、0.7wt％等。可以取生长的贴壁细胞进行完消化操作后作为待培养细胞。上述GE微载体在与细胞结合之前是需要灭菌处理的，具体灭菌处理方法为：PBS0.01MpH7.4配制4L高压灭菌121℃15min；用上述PBS浸泡微载体过夜，洗3次，beads沉淀底部，弃掉上清中破碎的灭菌后室温条件下用培养基平衡过夜，中间换一次培养液。分装10ml/管，4℃保存，用时取1ml加100ml培养基。优选地，作为进一步可实施的方案，接种后10-15rpm搅拌培养24-26h，18-30rpm搅拌培养24-72h。一般先慢速24h以上，然后再快速搅拌过夜，并观察细胞的生长状况。优选地，在不含血清的基础培养液培养过程中，氧气的浓度为4-7wt％，优选地氧气的浓度为5wt％。如果采用含有血清的培养液，后期纯化的过程中还需要额外增加去除的步骤，增加了操作复杂程度，而且含有血清的培养液会影响后续纯化后的产物进一步使用情况，因此最好选用不含血清的基础培养液，通过调整气氛中氧气的的含量，以保证细胞信使大量的分泌并保证其活性。优选地，作为进一步可实施的方案，所述GE微载体为Cytodex1GE。优选地，作为进一步可实施的方案，搅拌培养72h以上后，吸弃培养上清液，采用生理盐水洗涤，添加胰酶消化后，加入含血清的培养基，微载体脱落后，再添加新的GE微载体，即可。优选地，作为进一步可实施的方案，添加胰酶消化40-60s。具体传代的方法按照如下步骤进行：培养72小时后进行传代，吸取培养上清，加入生理盐水洗一遍，弃掉，再加入胰酶消化约40-60sec，加入含血清的培养基摇动转瓶，观察载体脱落，用一次性吸管吹打几次消化下来的载体，使其分散均匀，加入到新的转瓶中，再重新加入新的微载体1ml,密封，平放并转动转瓶让载体平铺至转瓶表面，放置快速转瓶机上，继续观察。通过观察，发现将微载体和细胞同时传代培养后于镜下可观察到载体呈圆形，均匀，贴壁，平铺于培养皿和转瓶表面上，可观察到载体表面有大量结合细胞，均贴壁生长。一段时间培养液变黄，换新培养液时，将瓶斜倾，轻轻吸取掉，倒入10或100ml新培养基，可见beads平铺于表面上。本专利技术还提供了采用上述方法培养得到的细胞信使，培养得到的细胞信使不仅活性好，培养获得的每种类型的细胞信使功能性均比较强，而且该方法本身操作简单，操作条件比较温和，细胞成活率高，为后续细胞规模化的培养提供了可供参照的方法，值得广泛推广应本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞规模化的培养方法，其特征在于，将待培养细胞与灭菌后的GE微载体接种于含血清的培养基，在生物培养器中培养，然后换成无血清培养基，在无血清培养基中继续培养4‑7d，收集上清液；所述待培养细胞为脐带间充质细胞、脂肪细胞中的一种或两种；优选地，所述待培养细胞的接种密度为(8‑9)*10

【技术特征摘要】
1.一种细胞规模化的培养方法，其特征在于，将待培养细胞与灭菌后的GE微载体接种于含血清的培养基，在生物培养器中培养，然后换成无血清培养基，在无血清培养基中继续培养4-7d，收集上清液；所述待培养细胞为脐带间充质细胞、脂肪细胞中的一种或两种；优选地，所述待培养细胞的接种密度为(8-9)*103cell/ml；更优选地，所述待培养细胞的接种密度为8.6*103cell/ml。2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，在无血清培养基培养过程中，氧气的浓度为4-7wt％，优选地氧气的浓度为5wt％。3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，接种后10-15rpm搅拌培养24-26h，再以18-30rpm搅拌培养24-72h。4.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：张永国，何君，
申请(专利权)人：张永国，
类型：发明
国别省市：北京,11