植物作为宿主在表达阿达木抗体中的应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及植物作为宿主在表达阿达木抗体的应用。本发明专利技术利用植物例如生菜作为重组蛋白质生产的有效表达平台，利用简单以及有效的农杆菌介导真空渗透方法来表达阿达木单克隆抗体(Adalimuab,Humira,修美乐)。该表达体系确定植物外源蛋白在农杆菌侵染4d后就可以收集。利用SDS‑PAGE法确定重组阿达木抗体成功表达。肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)中和实验证明生菜生产的阿达木抗体具有生物学活性。

Application of Plant as Host in Expressing Adam Antibody

【技术实现步骤摘要】
植物作为宿主在表达阿达木抗体中的应用
本专利技术涉及生物
，特别涉及植物作为宿主在表达阿达木抗体中的应用。
技术介绍
类风湿关节炎(RA)是一种以对称性、多关节、小关节为主的慢性自身免疫性疾病，素有“不死癌症”之称，患病者的免疫系统会破坏健康关节，引发关节疼痛、肿胀、僵硬，产生疲劳和无力的症状，晚期可强直和畸形、功能严重受损，并最终导致关节功能丧失。强直性脊柱炎(AS)是以骶髂关节和脊柱附着点炎症为主要症状的疾病。与HLA-B27呈强关联。某些微生物(如克雷白杆菌)与易感者自身组织具有共同抗原，可引发异常免疫应答。强直性脊柱炎是四肢大关节，以及椎间盘纤维环及其附近结缔组织纤维化和骨化，以及关节强直为病变特点的慢性炎性疾病。类风湿关节炎以及强直性脊柱炎都是致残率较高的疾病。目前阿达木单抗(Adalimuab,Humira,修美乐)对这两种炎症有明显效果。阿达木单抗是全人源化单克隆抗体的一种，也是一种可自我注射的生物治疗药物，是由英国CambridgeAntibodyTechnology(CAT)与美国雅培公司联合研制的全球首个被批准的肿瘤坏死因子α(TNFα)全人源单克隆抗体。美国在2003年批准阿达木单抗用于临床治疗类风湿关节炎以及强直性脊柱炎。阿达木单抗可减缓患者关节损伤的进展(X线显示)，并且可以改善身体机能，应用一段时间后，患者的身体功能及健康相关生活质量明显提高。现阶段主要利用动物细胞生产阿达木单抗。但是动物细胞培养需要价格昂贵的培养液，严格的厂房条件，操作复杂，时间周期至少两周，而且动物细胞生产能力低，生产成本极高。有时候动物细胞所带的病毒可以侵染人类，安全性低。因此，提供一种阿达木抗体的表达方法具有重要的现实意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了植物作为宿主在表达阿达木抗体中的应用。本专利技术利用植物尤其是生菜作为重组蛋白生产的高效平台技术，表达了阿达木抗体。并且在温和的条件下成功分离出有活性的外源蛋白，证明植物尤其是生菜表达平台可以成功用来生产阿达木抗体蛋白。时间短(4d)，纯化简单，生产便捷。消除基因污染，消除感染人体的潜在病虫害等。大大降低生产成本，提高产品安全性。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了植物作为宿主在表达阿达木抗体中的应用。优选的，所述抗体为单克隆抗体。所述植物选自生菜、白菜、玉米、大豆、烟叶或小麦；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。本专利技术还提供了一种表达载体，包括阿达木的重链序列或轻链序列以及载体。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述阿达木的重链序列或轻链序列为将阿达木重链、阿达木轻链的密码子优化为植物偏好的密码子，获得的优化的阿达木的重链序列或优化的阿达木的轻链序列。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述优化的阿达木的重链序列如SEQIDNo.1所示；所述优化的阿达木的重链的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；所述优化的阿达木的轻链序列如SEQIDNo.3所示；所述优化的阿达木的轻链的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述载体为双元植物载体。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述表达载体的构建方法包括如下步骤：步骤1：分别将阿达木重链、阿达木轻链的密码子优化为植物偏好的密码子，获得：ⅰ.优化的阿达木的重链序列；ⅱ.优化的阿达木的轻链序列；步骤2：在所述优化的阿达木的重链序列的5’末端分别加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端分别加入SacI位点；在所述优化的阿达木的轻链序列的5’末端加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端加入SacI位点；由金斯瑞克隆到pUC57载体中，分别获得pAda-H，pAda-L克隆载体；步骤3：通过Xbal/Sacl分别从步骤2所得的克隆载体中获得基因片段，克隆至双元植物载体pCam35S，分别获得表达载体p35S-Ada-H，p35S-Ada-L。具体的，为了提供外援蛋白在植物中的高效表达，本专利技术将人阿达木重链以及轻链(https://www.drugbank.ca/drugs/DB00051)氨基酸序列利用反翻译软件(https://www.idtdna.com/CodonOpt)得到核苷酸序列，并将其密码子优化为植物偏好的密码子，由金斯瑞公司(南京，中国)合成。在优化的阿达木重链序列5’末端分别加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端分别加入Sacl位点。在阿达木轻链序列5’末端分别加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端分别加入SacI位点。并由金斯瑞克隆到pUC57载体中(图1)，分别获得pAda-H，pAda-L克隆载体。基因片段通过XbaI/Sacl分别从克隆载体中分离，并克隆到双元植物载体pCam35S，分别产生植物表达载体p35S-Ada-H，p35S-Ada-L(图2)。本专利技术还提供了所述的表达载体在表达阿达木抗体中的应用。此外，本专利技术还提供了一种植物作为宿主表达阿达木抗体的方法，将本专利技术提供共的表达载体转化到农杆菌中，通过农杆菌介导真空渗透入植物组织后，提取、分离蛋白质，获得阿达木抗体。所述植物选自生菜、白菜、玉米、大豆、烟叶或小麦；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。具体的，将两种植物表达载体p35S-Ada-H，p35S-Ada-L分别通过用Multiporator(Eppendorf，Hamburg，Germany)电穿孔转化到根癌土壤杆菌GV3101中。将所得菌株均匀地铺展在含有卡那霉素抗生素(50mg/L)的选择性LB平板上。在黑暗中28℃孵育2d后，挑取单菌落接种到0.5LYEB(酵母提取物肉汤，5g/L蔗糖，5g/L胰蛋白胨，6g/L酵母提取物，0.24g/LMgSO4，pH7.2)并补充抗生素液体培养基(50mg/L卡那霉素)。将接种的培养物在振荡器(220rpm)中以25～28℃孵育72h。通过添加YEB培养基测量OD600值并调节至3.5～4.5。然后收集培养液，离心(4500转速)10min。将农杆菌细胞重悬在渗透培养基(10mMMES，10mMMgSO4)中至O.D.600为0.5。将制备好的含有p35S-Ada-H和p35S-Ada-L农杆菌等量混匀至O.D.600为0.5；。将培养悬浮液置于2L烧杯，并置于干燥器中。将本实验室保存的生菜倒置(核心向上)并轻轻地旋转于细菌悬浮液中，将干燥器密封。将真空泵(WelchVacuum，Niles，IL，USA)打开以抽空，并且可见渗透液在叶片组织中。保持压力状态30～60s。快速打开该系统以释放压力，使渗透液渗入组织内的空间。该过程重复2～3次，直到清晰可见渗透液在生菜组织中扩散明显。然后将生菜组织从渗透液中轻轻取出，并用蒸馏水连续冲洗三次，然后转移到塑料膜覆盖的容器中。将处理的样品在黑暗中保持4d。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述农杆菌介导真空渗透包括如下步骤：步骤1：抽真空25～45s；步骤2：保持真空(-95kPa)压力30～60s；步骤3：释放压力使得渗透液渗入所述植物组织；重复上述步骤2～3次，避光处理4d。在本专利技术的一些具体实施方案中，农杆菌具体为根癌土壤杆菌GV3101。本专利技术所述克隆pAda-H，pAda-L基因片段，并且构建两种双元植物表达载体p35S-Ada本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.植物作为宿主在表达阿达木抗体中的应用；所述植物选自生菜、白菜、玉米、大豆、烟叶或小麦；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。

【技术特征摘要】
1.植物作为宿主在表达阿达木抗体中的应用；所述植物选自生菜、白菜、玉米、大豆、烟叶或小麦；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。2.一种表达载体，其特征在于，包括阿达木的重链序列或轻链序列以及载体。3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述阿达木的重链序列或轻链序列为将阿达木重链、阿达木轻链的密码子优化为植物偏好的密码子，获得的优化的阿达木的重链序列或优化的阿达木的轻链序列。4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述优化的阿达木的重链序列如SEQIDNo.1所示；所述优化的阿达木的重链的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；所述优化的阿达木的轻链序列如SEQIDNo.3所示；所述优化的阿达木的轻链的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示。5.根据权利要求2至4任一项所述的表达载体，其特征在于，所述载体为双元植物载体。6.根据权利要求2至5任一项所述的表达载体，其特征在于，其构建方法包括如下步骤：步骤1：分别将阿达木重链、阿达木轻链的密码子优化为植物偏好的密码子，获得：ⅰ.优化的阿达木的重链序列；ⅱ.优化的阿达木的轻链序列；步骤2：在所述优化的阿达木的重...

【专利技术属性】
技术研发人员：王跃驹，陈雪，陈书元，
申请(专利权)人：北京睿诚海汇健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11