一种鼻咽癌标志物的检测引物、探针及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因治疗和医学诊断技术领域，本发明专利技术提供了一种生物学标志物EBV‑miR‑BART13在制备鼻咽癌早期诊断和预后预测的诊断试剂盒中的应用，本发明专利技术进一步提供了一种针对EBV‑miR‑BART13检测来进行鼻咽癌诊断的试剂盒，包括：（1）血浆中总RNA的提取；（2）血浆中EBV‑miR‑BART13的cDNA合成；（3）探针法检测EBV‑miR‑BART13表达。本发明专利技术生物学标志物EBV‑miR‑BART13可作为早期诊断和预测预后的生物学标志物，该试剂盒诊断鼻咽癌的敏感度高，特异性强。

A Detection Primer, Probe and Its Application for Nasopharyngeal Carcinoma Markers

【技术实现步骤摘要】
一种鼻咽癌标志物的检测引物、探针及其应用
本专利技术涉及基因治疗和医学诊断
，具体涉及一种生物学标志物EBV-miR-BART13在制备鼻咽癌早期诊断和预后预测的诊断试剂盒中的应用。
技术介绍
鼻咽癌是我国南方的恶性肿瘤之一,好发于青壮年（35-55岁）,年标化发病率可高达15-30/100000。早期鼻咽癌5年生存率可达90%,但晚期患者仅50%左右。由于解剖部位特殊，早期症状隐匿,70%以上的患者就诊时已是中晚期。因此,研究鼻咽癌的发病机制,发现简单、有效的肿瘤标志物,以提高鼻咽癌早期诊断率和预测预后能力,是鼻咽癌未来防治的重点工作。EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)感染是鼻咽癌的最主要致病因素之一。研究发现：几乎100%的非角化型鼻咽癌具有EBV感染，因此,通过检测EBV基因产物可协助鼻咽癌的诊断。关于鼻咽癌外周血标志物的探讨显示,在EBVEBNA-IgA和VCA-IgA持续升高人群中,鼻咽癌的发病风险呈逐年升高,但作为NPC早期筛查和诊断指标,其敏感性及特异性很低,例如EBVVCA-IgA阳性人群中NPC的检出率仅为3.19%。血浆EBVDNA是目前研究最多的鼻咽癌肿瘤标志物,在NPC的筛查、早期诊断、治疗和预后检测方面均有临床价值。利用血浆中的EBVDNA筛查早期无症状NPC患者,其敏感性及特异性分别为97.1%、98.6%，且数据显示NPC患者确诊时间明显提前,预后更佳。但是,由于各个实验室EBVDNA检测技术、检测平台、阈值等不一致,目前没有标准化的流程，导致其诊断鼻咽癌的实用性、可重复性、推广性存在很大的困难。因此,血浆EBVDNA是否能作为理想的鼻咽癌肿瘤标志物有待进一步研究。微小RNA（microRNA,miRNA）是一类长度约为20～23个核苷酸的小分子非编码RNA,它通过与靶基因完全或不完全的互补配对,降解靶基因或阻遏其转录或翻译。miRNA可通过扮演癌基因或抑癌基因角色,从而参与肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡、侵袭转移、免疫逃逸等过程,是近几年肿瘤标志物的研究热点。目前研究发现，EBV共编码22个EBV-miR-BARTs前体,形成44个成熟的miRNA,且EBV-miR-BARTs大量表达于鼻咽癌组织中，而在健康者或非鼻咽癌癌症患者中低表达或不表达。因此,筛选鼻咽癌中特异表达的EBV-miR-BARTs,作为潜在的鼻咽癌早期筛查、早期诊断、最佳治疗方案决策、预测预后、检测复发等方面的肿瘤生物学标志,具有极其重要的临床意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种生物学标志物EBV-miR-BART13在制备鼻咽癌早期诊断和预后预测的诊断试剂盒中的应用。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种生物学标志物EBV-miR-BART13在制备鼻咽癌早期诊断和预后预测的诊断试剂盒中的应用，所述EBV-miR-BART13的序列如SEQIDNo.1所示：UGUAACUUGCCAGGGACGGCUGA。该试剂盒是通过PCR技术检测生物样品中EBV-miR-BART13的表达量。所述试剂盒包括对EBV-miR-BART13具有检测特异性的引物序列和探针，其序列如下：上游引物为miR-BART13-F：5’-GTCGTTGTAACTTGCCAGG-3’;下游引物为miR-BART13-R：5’-GTGCAGGGTCCGAGGTAT-3’;探针为：5’-FAM-CTGGATACGACTCAGCCG-BHQX-3’，5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团是BHQX。所述试剂盒包括：（1）血浆中总RNA的提取；（2）血浆中EBV-miR-BART13的cDNA合成；（3）探针法检测EBV-miR-BART13表达。本专利技术的优点在于：本专利技术通过筛选鼻咽癌中特异表达的EBV-miR-BART13，作为潜在的鼻咽癌早期筛查、早期诊断、最佳治疗方案决策、预测预后、检测复发等方面的肿瘤生物学标志，具有极其重要的临床意义。附图说明图1为鼻咽癌患者与健康人群EBV-miR-BART13表达量测定结果。图2为鼻咽癌患者放疗前后EBV-miR-BART13表达量的测定结果。图3为血浆中EBV-miR-BART13表达量与肿瘤负荷的关系；其中3a为T1-T4阶段；3b为N0-N3阶段；3c为临床病理Ⅰ-Ⅳ期。图4为预后价值分析图。具体实施方式实施例11、血浆中总RNA的提取（1）准备血浆,吸480ul血浆装入2ml的AXYGEN的RNA酶free/ClearEP管中；（2）每管避光加入1mlTRAZOLplus，涡旋15秒，裂解静止30分钟；（3）每管避光加入200ul的氯仿，涡旋30秒，静置30分钟，分层一半为较理想的状态；（4）离心15000g，25分钟，4℃，可见到标本分层3层，收集最上层澄清液（500-800ul）放在RNA酶free的1.5ml-2.0mlEP管中。（5）按照1:1体积加入异丙醇,涡旋15s，-20℃冰箱静置过夜；（6）从-20℃冰箱中取出，4℃离心20000g，30分钟，可见沉淀；（7）弃上清液,倒置在滤纸上，晾干,加入1.4ml-1.8ml(看管子的大小,装接近满,1:1的量)新鲜配置的75%酒精，涡旋15s，离心20000g，30分钟，4℃。（8）弃上清液,倒置在滤纸上，晾干5-10分钟，没有晾干的，可用枪尖吸取管壁预留酒精，或用滤纸将EP管上半部的酒精吸干，防止酒精残留影响后面的实验。晾干的30分钟，保证酒精已经挥发干净。（9）枪尖深入管壁底部，加入15uL的无酶水，涡旋15s，用手甩下管壁上的液体，低速（<2000g）离心数秒，可继续冰上放置10分钟左右，让RNA充分溶解，后置-80℃冰箱保存待用。2、血浆中EBV-miR-BART13的cDNA合成利用TaqMan®SmallRNAAssays将RNA逆转录为cDNA。（1）Mix反应液配置（按顺序加样）表1Mix反应液表mir-BART13-RT引物序列为：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAGCC-3’。（2）设置反应条件在PCR仪中按表2的反应条件进行逆转录反应。表2反应条件3、探针法检测EBV-miR-BART13表达利用TaqMan®UniversalMasterMixII检测EBV-miR-BART13表达量，按表3组分进行反应液配制。表3探针法检测试剂表实施例2检测结果分析利用实施例1的方法检测207例健康体志愿者，12例良性疾病病人，24例非鼻咽癌病人和479例NPC患者。患者基本资料如表4所示。表4NPC患者基本资料表由图1可知，在NPC的血浆中可检测到EBV-miR-BART13-3p高表达,而健康志愿者、良性疾病者及其他肿瘤病人中无法检测到。其中以980copie/ml为血浆中EBV-miR-BART13-3p作为鼻咽癌诊断的临界值，其灵敏度为95.37%，特异度为98.82%。进行放疗治疗后，患者血浆中的EBV-miR-BART13-3p表达量基本降低至正常水平（图2）。说明EBV-miR-BART13-3p表达量可作为NPC早期筛查和诊断指标，可协助鼻咽癌的诊断。分别检测NPC患者肿本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生物学标志物EBV‑miR‑BART13在制备鼻咽癌早期诊断和预后预测的诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述EBV‑miR‑BART13的序列如SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种生物学标志物EBV-miR-BART13在制备鼻咽癌早期诊断和预后预测的诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述EBV-miR-BART13的序列如SEQIDNo.1所示。2.根据权利要求1所述的一种生物学标志物EBV-miR-BART13在制备鼻咽癌早期诊断和预后预测的诊断试剂盒中的应用，其特征在于，该试剂盒是通过PCR技术检测生物样品中EBV-miR-BART13的表达量。3.根据权利要求2所述的一种生物学标志物EBV-miR-BART13在制备鼻咽癌早期诊断和预后预测的诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒包括对EBV-miR-BART13具有检测特异性的引物序列和探针，其序列如下...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘建基，陈毅歆，林可焴，卢天柱，陈梦媛，陈鸿霖，苏颖，林城，林少俊，宗井凤，郭巧娟，
申请(专利权)人：福建省肿瘤医院福建省肿瘤研究所，福建省癌症防治中心，
类型：发明
国别省市：福建,35