一种提取核酸的方法、提取介质、试剂盒技术

本发明专利技术提供一种提取核酸的方法，将针对目标核酸特异性的抗体与特定材料进行偶联，获得核酸提取材料；将待提取样品加入所述核酸提取材料，核酸提取材料与核酸进行特异性结合，进而进行核酸提取，获得核酸‑核酸提取材料复合物；用洗涤液洗涤，得到除去杂质的核酸‑核酸提取材料复合物；进行洗脱，获得目标核酸分子。本发明专利技术还提供了一种核酸提取介质，所述核酸提取介质包括由针对目标核酸的抗体和提取材料偶联所得的核酸提取材料。本发明专利技术还提供了一种提取核酸的试剂盒。本发明专利技术针对现有技术对小片段核酸提取回收率低的缺陷，利用免疫抗体特异性、专一性的捕获的特性，将针对目标核酸的抗体偶联到特定材料上，再对核酸进行提取和纯化，提高了核酸提取的回收率和效率。

A Method, Medium and Kit for Nucleic Acid Extraction

【技术实现步骤摘要】
一种提取核酸的方法、提取介质、试剂盒
本专利技术涉及生物
，具体的说是涉及一种提取核酸的方法、提取介质、试剂盒。
技术介绍
1948年，Mandel和Metais首次报道了人类血液中游离DNA(cell-freeDNA,cfDNA)的存在。cfDNA是一种无细胞状态的、片段化的胞外DNA，主要存在于血液、骨膜液和脑脊液等体液中。大量研究发现，cfDNA含量增高对肿瘤早起诊断、无创产前诊断、疗效检测和预后判断等方面具有很高的临床价值。除此之外，cfDNA在器官移植、脑卒中、自身免疫病和心肌梗死等疾病上的应用价值也日益清晰。cfDNA在血浆内的含量极低，大致范围在15-40ng/ml。肿瘤患者cfDNA中存在循环肿瘤DNA(circulatingtumorDNA)。ctDNA上具有体细胞突变、DNA甲基化、拷贝数变异等肿瘤特异性基因改变信息，因此ctDNA可作为肿瘤诊断、检测、预后及指导临床个体化给药的工具。cfDNA含量少且高度片段化，大部分cfDNA片段长度在166bp左右，其中大部分来源于正常组织，只有极少量是肿瘤来源的ctDNA。肿瘤来源的ctDNA比正常组织来源的cfDNA更短。＜150bp的cfDNA越多，其中含有的ctDNA比例越高。因此，获得更多片段cfDNA进行下游分析可有效提高ctDNA的检测灵敏度。cfDNA的检测分为定量检测cfDNA浓度、定性检测ctDNA中基因突变和检测cfDNA完整性指数。为了获得可靠的检测结果，首先要有高质量的cfDNA模板，而cfDNA高度片段化的特点导致其在提取过程中已丢失，提取难度大，给临床应用cfDNA进行疾病诊断等工作造成困难。因此，提取到浓度高、短片段更多的cfDNA对于临床cfDNA下游检测至关重要。目前，很多商品化试剂盒可用于cfDNA提取，主要分为磁珠法和硅胶膜离心柱法，从原理上来说都是依靠二氧化硅材料表面的硅羟基与cfDNA之间的非特异性结合而实现的。市场上最主要的产品为Qiagen公司的QIAamp游离核酸提取试剂盒(QiagenCANkit)。相关研究表明，对于长度为75bp和91bp的短核酸片段，目前市场上的试剂盒提取回收率较高的为31.8％-33.7％；对于长度为157bp的核酸片段，目前市场上的试剂盒提取回收率为40％左右；对于长度为195bp和303bp的中长核酸片段，目前市场上的试剂盒提取回收率较高的为75.5％-77.6％；对于长度为398bp的核酸长片段，目前市场上的试剂盒提取回收率为76.0％-87.4％。虽然目前核酸提取技术比较成熟，但是对于一些要求比较严格，如单细胞基因组测序(分离的单个细胞的微量全基因组DNA)，或者本身DNA存在量就较少,如胎儿外周血游离DNA。目前的方法针对这些应用领域的核酸提取就有一些限制和不足。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的一个目的是提供一种核酸提取方法，采用免疫抗体特异性、专一性的捕获方法来提取核酸，可以提高对核酸的提取回收率，尤其是对于小片段的核酸，能够高效率并精准的捕获到相应核酸，达到将核酸从复杂的体液样本环境中提取和纯化的目的。本专利技术提供的一种核酸提取方法，包括如下步骤：偶联、将针对目标核酸的抗体与提取材料进行偶联，获得核酸提取材料；提取、将待提取样品加入到所述核酸提取材料中，所述核酸提取材料与待提取样品中的目标核酸特异性结合，获得核酸-核酸提取材料复合物；洗涤、用洗涤液洗涤所述核酸-核酸提取材料复合物，以得到除去杂质的核酸-核酸提取材料复合物；洗脱、将经洗涤后的所述核酸-核酸提取材料复合物进行洗脱，以获得目标核酸分子。优选地，所述针对目标核酸的抗体包括抗DNA抗体、抗RNA抗体。优选地，所述针对目标核酸的抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、抗体Fab段、单链抗体、单域抗体。其中，所述针对目标核酸的抗体还包括抗DNA抗体类似物、抗RNA抗体类似物；所述抗体类似物包括抗体Fab段、单链抗体、单域抗体、模拟多肽、核酸适配体。优选地，所述核酸包括甲基化DNA、甲基化RNA；所述针对目标核酸的抗体包括抗甲基化DNA的抗体、抗甲基化RNA的抗体。优选地，所述的抗甲基化DNA的抗体包括抗5-甲基胞嘧、抗N6甲基嘌呤、抗7-甲基鸟嘌呤；所述的抗甲基化RNA的抗体包括抗N6-甲基腺嘌呤、抗1-甲基腺苷、抗7-甲基鸟苷、抗5-甲基胞苷、抗N2-二甲基鸟苷、抗5-(羟甲基)胞苷、抗N-乙酰胞嘧啶核苷。本专利技术的第二个目的是提供一种核酸提取介质，所述核酸提取介质包括根据上述提取核酸中偶联步骤所制得的核酸提取材料。优选地，所述核酸提取材料为天然的或者经过化学基团修饰的能够与所述针对目标核酸的抗体偶联的介质；所述化学基团包括氨基、羧基、苯基、酚基、巯基、羟基、咪唑基、吲哚基、胍基。优选地，所述核酸提取材料的材质包括胶原、蚕丝、纤维素、磁小体、壳聚糖、二氧化硅。优选地，所述核酸提取材料材质的呈现结构包括微孔膜、微球、纤维填料、多孔介质、硅基微流控芯片。其中，所述微球包括磁珠、聚苯乙烯微球、交联琼脂糖微球、乳胶微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球。本专利技术的第三个目的，是提供一种提取核酸的试剂盒，包括本专利技术如上所述核酸提取介质、洗涤液、洗脱液。本专利技术所述针对目标核酸的抗体，是指能够与待处理样品中的目标核酸特异性结合的抗体。本专利技术所述的核酸提取材料是指能够与针对目标核酸抗体进行偶联的提取材料，所述提取材料材质包括但不限于天然的或者经过化学基团修饰的胶原、蚕丝、纤维素、磁小体、壳聚糖、二氧化硅，所述提取材料材质的呈现结构包括但不限于天然的或经过化学基团修饰的微孔膜、微球、磁珠、纤维填料、多孔介质、硅基微流控芯片。本专利技术通过将所述提取材料材质制备成微孔膜、微球、磁珠、纤维填料、多孔介质再与针对目标核酸的抗体进行偶联，或将所述提取材料材质应用在硅基微流控芯片中的核酸包被区中再与针对目标核酸的抗体进行偶联，从而可以有针对性的、高效地提取待处理样品中的核酸。其中所述提取材料材质的呈现结构中广泛使用的是磁珠，磁珠是一种具有细小粒径的超顺磁微球，具有超强的顺磁性。本专利技术通过采用胶原、蚕丝、纤维素、磁小体、壳聚糖、二氧化硅等能够偶联所述的针对目标核酸抗体的材料或对其制备的微孔膜、微球、磁珠、纤维填料、多孔介质进行一定的化学基团修饰(如氨基、羧基、苯基等)后，再与针对目标核酸的抗体进行偶联，即可获得本专利技术的核酸提取材料，能够与核酸相互作用，能可逆的形成核酸-核酸提取材料复合物，进而可以用于提取核酸。相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：选择针对目标核酸特异性结合的抗体，将该抗体与提取材料进行偶联并结合在一起，获得核酸提取材料，再对待提取的样品进行核酸提取。采用免疫抗体特异性、专一性的捕获方法来提取核酸，可以高效率并精准的捕获到相应核酸，达到将核酸从复杂的体液样本环境中提取和纯化的目的。尤其对于含有小片段核酸或者核酸含量较低的待处理样品，本专利技术的核酸的提取方法、提取介质、提取核酸的试剂盒具有较高特异的识别性，大大地了提高核酸提取时的回收率。上述说明仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以一些实施例来详细说明。本专利技术的具体实施方式由以下实施例详细给出。附图说明此处所说本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提取核酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：偶联、将针对目标核酸的抗体与提取材料进行偶联，获得核酸提取材料；提取、将待提取样品加入到所述核酸提取材料中，所述核酸提取材料与待提取样品中的目标核酸特异性结合，获得核酸‑核酸提取材料复合物；洗涤、用洗涤液洗涤所述核酸‑核酸提取材料复合物，以得到除去杂质的核酸‑核酸提取材料复合物；洗脱、将经洗涤后的所述核酸‑核酸提取材料复合物进行洗脱，以获得目标核酸分子。

【技术特征摘要】
1.一种提取核酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：偶联、将针对目标核酸的抗体与提取材料进行偶联，获得核酸提取材料；提取、将待提取样品加入到所述核酸提取材料中，所述核酸提取材料与待提取样品中的目标核酸特异性结合，获得核酸-核酸提取材料复合物；洗涤、用洗涤液洗涤所述核酸-核酸提取材料复合物，以得到除去杂质的核酸-核酸提取材料复合物；洗脱、将经洗涤后的所述核酸-核酸提取材料复合物进行洗脱，以获得目标核酸分子。2.根据权利要求1所述的提取核酸的方法，其特征在于，所述针对目标核酸的抗体包括抗DNA抗体、抗RNA抗体。3.根据权利要求1所述的提取核酸的方法，其特征在于，所述针对目标核酸的抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、抗体Fab段、单链抗体、单域抗体。4.根据权利要求1所述的提取核酸的方法，其特征在于，所述核酸包括甲基化DNA、甲基化RNA；所述针对目标核酸的抗体包括抗甲基化DNA的抗体、抗甲基化RNA的抗体。5.根据权利要求4所述的提取核酸的方法，其特征在于，所述的抗甲基化DN...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏双施，王红梅，陈晔洲，段生宝，丁少华，李勇，
申请(专利权)人：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，
类型：发明
国别省市：江苏,32