一种RNA依赖的RNA聚合酶制备方法与应用技术

本发明专利技术公开一种RNA依赖的RNA聚合酶制备方法与应用，该制备方法以香石竹斑驳病毒属病毒作为原料，利用含聚合酶结构域且无N‑末端的跨膜区或跨膜区突变的病毒复制蛋白为基础制备重组蛋白，获得具有RNA依赖的RNA聚合酶，具体为首先选取番茄丛矮病毒科的香石竹斑驳病毒属病毒作为原料；然后利用截短或突变除去病毒RNA的N‑末端的跨膜区，得到模板RNA；最后通过原核表达或真核表达在细胞内或细胞外进行RNA聚合酶的合成；采用本发明专利技术的方法获得重组蛋白，其RNA产量大于1毫克/毫升，适合工业化RNA的合成与生产。

Preparation and Application of RNA-Dependent RNA Polymerase

【技术实现步骤摘要】
一种RNA依赖的RNA聚合酶制备方法与应用
本专利技术属于酶生产
，具体的，涉及一种RNA依赖的RNA聚合酶制备方法与应用。
技术介绍
RNA是真核细胞与原核细胞中的一种重要成分，它参与转录、翻译等多种重要的的功能，转录即基因组信息转移，基因组信息是指DNA信息，将这一信息由细胞核转移至细胞质，翻译是指将转录信息翻译为氨基酸或蛋白质，而RNA聚合酶是以一条DNA链或RNA为模板，三磷酸核糖核苷为底物、通过磷酸二酯键而聚合的合成RNA的酶，因为在细胞内与基因DNA的遗传信息转录为RNA有关，所以也称转录酶；在现有技术中，无法通过RNA模板高效合成RNA，因此导致该技术无法应用于工业化生产，为了解决这一问题，本专利技术提供了以下技术方案。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种RNA依赖的RNA聚合酶制备方法与应用。本专利技术需要解决的技术问题为：在现有技术中，无法以RNA为模板高效地合成RNA，导致无法适用于工业化的RNA聚合酶合成与生产。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：一种RNA依赖的RNA聚合酶制备方法，包括如下步骤：a、选取番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)香石竹斑驳病毒属(Carmovirus)病毒作为原料；b、利用截短或突变除去病毒RNA的N-末端的跨膜区，以去除病毒蛋白的细胞毒性并增强重组蛋白的可溶性；c、通过原核表达或真核表达在细胞内或细胞外进行RNA聚合酶的合成。作为本专利技术的进一步方案，所述步骤b中通过突变除去N-末端的跨膜区的具体方法为缺失突变或点突变；作为本专利技术的进一步方案，在细胞外制备目标RNA时，首先RNA聚合酶通过原核表达或真核表达后纯化，成为酶制品，在细胞外的缓冲液环境中，利用目标模板RNA合成互补链RNA，在本专利技术的一个实施例中，缓冲液由100mMKCl、5mMMgCl2与pH7.5的50mMTris-HCl组成；作为本专利技术的进一步方案，在细胞内制备目标RNA时，将聚合酶模板RNA构建在真核表达载体中，在真核细胞内表达后，利用细胞内的目标模板RNA合成互补链RNA；所述真核表达载体包括但不限于哺乳动物表达载体、昆虫表达载体、酵母表达载体；其中，将聚合酶模板RNA构建在真核表达载体中的方法为：S1、细胞的贴壁培养将待转染细胞加入培养瓶中，通过PBS缓冲液清洗待转染细胞，清洗结束后，向其中加入胰酶，通过胰酶消化分解胞外蛋白，从而使粘结在一起的细胞分离，通过显微镜观察细胞分离情况，当细胞没有大片连接时，向培养瓶中加入血清，其中血清能够抑制并破坏胰酶活性，使其失效，防止胰酶过度分解胞外蛋白，对细胞本身造成伤害；离心得到聚团细胞，通过PBS缓冲液清洗后再次离心，将PBS缓冲液去除，向细胞中加入MEM培养基并将细胞吹散，将细胞培养基加入培养瓶中，在37℃，5％二氧化碳的环境下静置培养，使细胞贴壁且相邻细胞不相互粘结，其中细胞贴壁的面积占培养瓶瓶底面积的60％-80％；该步骤中首先将培养的细胞进行分离，避免出现多个细胞聚团的情况，待细胞相互分散后，再对已经分散的细胞进行培养，使细胞贴壁生长，这样能够提升细胞暴露出的细胞膜的面积，从而提升后续处理的效率；S2、转染液的制备向生理盐水中加入polylea非脂质体转染试剂，震荡分散均匀后，向其中加入乙醇与A23187载体，震荡分散后得到前体待用；通过MEM培养基配制浓度为0.1-1g/L的聚合酶模板RNA，然后将其滴加入前体中，滴加过程中不断震荡容器，使两者混合均匀；S3、转染将步骤S1中得到的内壁贴壁生长有细胞的培养瓶取出后，将培养液倒出，向培养瓶中滴加转染液，滴加时转染液沿瓶壁滑入，防止液滴冲击力将贴壁生长的细胞与培养瓶分离；将培养瓶在37℃、5％二氧化碳的环境下静置培养10-15min后，超声处理20-26min，然后在37℃、5％二氧化碳的环境下培养4-8h后完成转染。在进行超声处理的过程中，为了保证超声的均匀性，超声发生点设置在培养瓶的正下方，且超声发生点与培养瓶之间的距离≥15cm；在该步骤中，首先将培养瓶中细胞在37℃、5％二氧化碳的环境下静置培养10-15min，这一过程中，A23187载体诱导细胞内钙离子浓度迅速升高，从而提升细胞的摄取能力，然后通过超声处理，利用超声提升细胞膜表面的疏松性，加速聚合酶模板RNA进入细胞内，最后再通过静置培养，使聚合酶模板RNA完成转染，整个过程通过超声缩短转染培养时间，同时通过A23187载体作用缩短超声处理时间，即达到了缩短转染时间的效果，又不会大大延长超声时间，保证细胞结构的完整性。作为本专利技术的进一步方案，对病毒来源的蛋白可以通过但不局限于添加标签序列的方式，以便于原核或真核表达后的纯化；作为本专利技术的进一步方案，提高聚合酶酶活的方法包括但不局限于：提高细胞内基因的拷贝数、提高酶的表达水平、改变酶的序列从而提高稳定性、去除引起抑制的氨基酸残基与改变蛋白质的转运和胞内聚集；作为本专利技术的进一步方案，通过将与目标模板RNA互补配对的短RNA与模板形成双链结构，利用该双链结构作为引物，能够促进互补链RNA的合成，提高RNA合成效率；作为本专利技术的进一步方案，通过将目标模板RNA的3’末端设计为与自身互补配对，并将配对后的末端RNA作为引物，能够促进互补链RNA的合成。在本专利技术的一个实施例中，所述步骤a中所述番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)香石竹斑驳病毒属病毒具体为芜菁皱缩病毒(Turnipcrinklevirus)，其中芜菁皱缩病毒的复制蛋白编码区序列中，1-753位包含穿膜区(即有下划线部分)，754-2328位包含RNA聚合酶活性，通过截短或突变将序列中1-753位的穿膜区除去，以序列中754-2328位作为RNA模板来合成互补链RNA，其RNA产量为模板RNA量的95％以上。本专利技术的有益效果：本专利技术利用含聚合酶结构域且无N-末端的跨膜区或跨膜区突变的香石竹斑驳病毒属病毒为基础制备重组蛋白，其RNA产量大于1mg/mL，适合工业化RNA的合成与生产。附图说明下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步详细描述。图1为芜菁皱缩病毒的复制蛋白编码区序列。具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1一种RNA依赖的RNA聚合酶制备方法，包括如下步骤：a、选取芜菁皱缩病毒作为原料；b、利用截短或突变除去病毒RNA的N-末端的跨膜区，以去除病毒蛋白的细胞毒性并增强重组蛋白的可溶性；c、通过原核表达或真核表达在细胞内或细胞外进行RNA聚合酶的合成。所述步骤b中通过突变除去N-末端的跨膜区的具体方法为缺失突变；具体的，在细胞内制备目标RNA时，将聚合酶模板RNA构建在真核表达载体中，在真核细胞内表达后，利用细胞内的目标模板RNA合成互补链RNA；所述真核表达载体为哺乳动物表达载体；其中将聚合酶模板RNA构建在真核表达载体中的方法为：S1、细胞的贴壁培养将待转染细胞加入培养瓶中，通过PBS缓冲液清洗待转染细胞，清洗结束后，向其中加入胰酶，通过胰酶消化分解胞外蛋白，从而使粘结在一起本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种RNA依赖的RNA聚合酶制备方法，其特征在于，包括如下步骤：a、选取番茄丛矮病毒科的香石竹斑驳病毒属病毒作为原料；b、利用截短或突变除去病毒RNA的N‑末端的跨膜区，得到模板RNA；c、通过原核表达或真核表达在细胞内或细胞外进行RNA聚合酶的合成。

【技术特征摘要】
1.一种RNA依赖的RNA聚合酶制备方法，其特征在于，包括如下步骤：a、选取番茄丛矮病毒科的香石竹斑驳病毒属病毒作为原料；b、利用截短或突变除去病毒RNA的N-末端的跨膜区，得到模板RNA；c、通过原核表达或真核表达在细胞内或细胞外进行RNA聚合酶的合成。2.根据权利要求1所述的一种RNA依赖的RNA聚合酶制备方法，其特征在于，所述步骤b中通过突变除去N-末端的跨膜区的具体方法为缺失突变或点突变。3.根据权利要求1所述的一种RNA依赖的RNA聚合酶制备方法，其特征在于，所述番茄丛矮病毒科的香石竹斑驳病毒属病毒具体为芜菁皱缩病毒。4.根据权利要求1所述的一种RNA依赖的RNA聚合酶制备方法制备得到的RNA聚合酶，其特征在于，该RNA聚合酶用于在细胞内或细胞外制备目标RNA。5.根据权利要求4所述的RNA聚合酶的应用，其特征在于，在细胞外制备目标RNA时，首先RNA聚合酶通过原核表达或真核表达后纯化，成为酶制品，在细胞外的缓冲液环境中，利用目标模板RNA合成互补链RNA。6.根据权利要求4所述的RNA聚合酶的应用，其特征在于，在细胞内制备目标RNA时，将聚合酶模板RNA构建在真核表达载体中，在真核细胞内表达后，利用细胞内的目标模板RNA合成互补链RNA。7.根据权利要求6所述的RNA聚合酶的应用，其特征在于，将聚合酶模板RNA构建在真核表达载体中的方法为：S1、细胞的贴壁培养将待转染细胞加入培养瓶中，通过PBS缓冲液清洗待转染细胞，清洗结束后，向其中加入胰酶，通过胰酶消化分解胞外蛋白，从而使粘结在一起的细胞分离，再向培养瓶中加入血...

【专利技术属性】
技术研发人员：李正和，许凯，裘炀琳，
申请(专利权)人：李正和，许凯，
类型：发明
国别省市：浙江,33