一种Ⅰ群11d型禽腺病毒株、灭活疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种Ⅰ群11d型禽腺病毒株、灭活疫苗及其制备方法。所述的Ⅰ群11d型禽腺病毒株，命名为禽腺病毒RC18，该病毒株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17404。实验证明，本发明专利技术分离得到的I群11d型禽腺病毒RC18株毒价高，增殖能力强，免疫原性好，与流行株匹配，将其制备成灭活疫苗免疫实验鸡后能抵御临床流行的I群禽腺病毒(血清11d型)对鸡群的感染，免疫应答产生迅速，攻毒保护率高，并且未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应，安全性高，稳定性好。本发明专利技术的提出为鸡包涵体肝炎的防治提供了一种有效技术手段。

A group I 11d avian adenovirus strain, inactivated vaccine and its preparation method

【技术实现步骤摘要】
一种Ⅰ群11d型禽腺病毒株、灭活疫苗及其制备方法
本专利技术涉及一种病毒毒株及灭活疫苗，具体涉及一种Ⅰ群11d型禽腺病毒株、灭活疫苗及其制备方法，属于兽用生物制品

技术介绍
鸡包涵体肝炎(Inclusionbodyhepatitis，IBH)是因I群禽腺病毒(FAdV)引起的传染病，是目前流行的、急性、高度接触性的一种鸡传染病，在我国部分地区流行。其病原为禽腺病毒(Fowladenovirus，FAdV)血清8b型，在病毒分类上为腺病毒科，禽腺病毒属中的Ⅰ亚群禽腺病毒。FAdV属于禽腺病毒科(FamilyAdenoviridae)禽腺病毒属的无囊膜双股DNA病毒，可分为12个血清型，这些血清型之间表现出非常不同的病原性。在世界范围内，禽腺病毒2、3、8a、8b、9和11血清型可引起包涵体肝炎，在血清4型存在情况下，会引起心包积液肝炎综合征。目前在我国已知危害国内养鸡业的主要血清型是4型、8型、11型。该病原可导致7d～20W鸡发病，主要感染1-3周龄的肉鸡、817杂交肉鸡、麻鸡、黄鸡，3～7w多发。病鸡生长受阻、羽毛蓬乱、蹲伏。目前在我国山东、河南、河北等多个地区发生此病，该病既可以垂直传播，能够进行蛋传(eggtransmission)，种鸡群受到感染后一直无症状，但蛋传给后代雏鸡而引发严重病症，从而能够对肉鸡产业造成损害，同时也可水平传播。鸡感染后可成为终身携带者，并可间歇性排毒。鸡群发病后会突现3～7天的死亡高峰。可能至10％，个别可达30％。有时病程也可持续2-3w。，单独感染也能够导致高发病率和死亡率。在诊断方面，目前主要通过实验室的临床症状、组织病理变化、PCR扩增和病毒分离等方法进行确诊。在疫病防控方面，应用鸡胚和禽源细胞培养禽腺病毒可以为禽腺病毒疫苗的研究提供一定的材料，但因不同血清型禽腺病毒之间无交叉保护性，已有的毒株血清型对市场流行的毒株不能提供良好保护，因此，目前市场亟需开发一种新血清型禽腺病毒疫苗来弥补市场禽腺病毒疫苗防控不全面的情况。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种Ⅰ群11d型禽腺病毒株，以便为研制I群禽腺病毒灭活疫苗奠定基础。本专利技术中，提供的Ⅰ群11d型禽腺病毒株，命名为禽腺病毒RC18，分类命名为禽腺病毒D种血清11型(Adenovirussp.)，该病毒株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNO.17404，保藏时间为2019年3月21日。该病毒由发病鸡病料组织接种SPF鸡胚分离所得。所述病毒为禽腺病毒Ⅰ亚群中的D种，血清型为11型，病毒核酸为双股DNA，无囊膜；病毒颗粒直径为70～90nm，呈20面体对称结构。在氯化铯中浮密度为1.32～1.37g/ml；病毒对脂溶剂如乙醚、氯仿、脱氧胆酸钠、胰蛋白酶、2％酚、50％乙醇等具有抵抗力，同时耐受pH3～9，但在1：1000的甲醛中可被灭活。病毒的增殖也可被DNA抑制剂IuDR和BuDR所抑制；病毒对热具有较强的抵抗力，在60℃30min仍具有活力；病毒不能凝集鸡、鸭、火鸡及大鼠红细胞；该病毒可经7日龄鸡胚绒毛尿囊膜途径培养，也可以在鸡肝癌细胞(LMH细胞)上增殖。本专利技术的目的之二是提供一种所述的Ⅰ群11d型禽腺病毒株在制备I群禽腺病毒灭活疫苗中的用途。本专利技术的目的之三是提供一种I群禽腺病毒灭活疫苗及其制备方法。所述的一种I群禽腺病毒灭活疫苗，其含有灭活后的所述的Ⅰ群11d型禽腺病毒株。一种制备所述的I群禽腺病毒灭活疫苗的方法，包括将所述的Ⅰ群11d型禽腺病毒株接种鸡胚或鸡肝癌细胞(LMH细胞)、收获病毒抗原液、灭活和乳化的步骤。其中，优选的，具体步骤如下：1)病毒抗原液的制备a.病毒接种：将所述的Ⅰ群11d型禽腺病毒株通过绒毛尿囊膜的途径按103.0～104.0ELD50/0.1ml接种于7日龄SPF鸡胚，0.2ml/胚，37℃孵化箱培养，定期观察。弃24h内死胚；b.收获病毒抗原液：取接种48h～168h内死亡鸡胚的尿囊液和胚体，收集死胚尿囊液和胚体，将胚体无菌环境下研磨后与尿囊液一并装于灭菌容器内，－20℃保存；c.灭活：将收获的病毒抗原液浓缩至106.5ELD50/0.1ml，向浓缩后的病毒抗原液中加入终浓度为2％v/v的甲醛溶液摇匀，37℃灭活16～20h，得到灭活后的病毒抗原液；2)疫苗制备a.水相制备：在96份灭活后的病毒抗原液中加入灭菌的吐温-804份，边加边充分搅拌，直到吐温-80完全溶解；b.油相制备：按油相:水相体积比为3:1的比例计算油相用量，取注射用白油94份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80℃，再加入司本-806份，至温度达到130℃时维持30分钟，冷却后备用；c.乳化:取3份油相放入乳化罐内，150转/分速率边加边搅拌1份水相，待水相加完后持续保持低速搅拌30分钟混匀水油相，在20～25℃下，以4000r/min剪切速率剪切2次，直至乳化合格为止，制成所述的I群禽腺病毒灭活疫苗。相较于现有技术，本专利技术的有益效果是：1、本专利技术分离的到的I群11d型禽腺病毒RC18株毒价高，增殖能力强，免疫原性好，与流行株匹配，将其制备成灭活疫苗能抵御临床流行的I群禽腺病毒(血清11d型)对鸡群的感染。2、优选鸡胚接种方法和收获时间，提高病毒毒价滴度，满足制备高效价疫苗需求；3、本专利技术制备的禽腺病毒灭活疫苗安全性高，稳定性好，免疫应答产生迅速，攻毒保护率高。本专利技术制备的疫苗免疫实验鸡后未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。附图说明图1为禽腺病毒Hexon目的基因扩增；M：DNAMarker；1、2、4：目的产物；3：阴性对照；图2为禽腺病毒RC18株的遗传进化关系；图3为禽腺病毒RC18株感染鸡胚后的症状。具体实施方式下面结合具体实施方式做进一步的说明，这些实例仅用于说明，而不用于限制本专利的保护范围。实施例1禽腺病毒RC18株的分离鉴定1、流行病学调查2017至今，专利技术人从山东省河北等地区的部分白羽肉鸡、蛋鸡发现了一种以肝脏肿大出血特点的疾病，经临床调查和实验室检测，初步诊断为Ⅰ群禽腺病毒引起的包涵体肝炎，遂将有典型症状发病鸡的肝、脾、肺等病料组织采集后置于-70℃冰箱保存备用。2、病毒分离取病死鸡的肝脏研碎后，用按1:5的比例加入灭菌生理盐水制成悬液；反复冻融3次后，12000r/min离心10min，取上清；加入青霉素和链霉素各10000IU/ml，经0.22μm的微孔滤器过滤，保存备用。将上述制备的样本研磨液经绒毛尿囊膜途径接种7日龄SPF鸡胚，0.2ml/胚，弃24h内死胚，取接种48h～168h内死亡鸡胚的尿囊液和胚体，用上述方法处理后连续传代，观察每代死胚的肝组织，鸡胚表现为死胚、肝脏肿大和质脆，胚胎充血。收集死胚尿囊液，－20℃保存。3、病毒的鉴定3.1血凝性鉴定分别取上述病毒，进行纯化后浓缩2倍制备成待检病毒液。将待检病毒液用PBS在“V”型板中进行2倍连续倍比稀释，分别采用鸡、鸭、鹅、豚鼠、兔的1％红细胞悬液进行凝集试验。结果表明，4个病毒分离株对鸡、鸭、鹅、豚鼠、兔的1％红细胞悬液均无血凝性。3.2血清学鉴定使用Ⅰ群禽腺病毒标准株、EDSV-76京911株标准阳本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.Ⅰ群11d型禽腺病毒株，命名为禽腺病毒RC18，该病毒株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.17404，保藏时间为2019年3月21日。

【技术特征摘要】
1.Ⅰ群11d型禽腺病毒株，命名为禽腺病毒RC18，该病毒株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.17404，保藏时间为2019年3月21日。2.权利要求1所述的Ⅰ群11d型禽腺病毒株在制备I群禽腺病毒灭活疫苗中的用途。3.一种I群禽腺病毒灭活疫苗，其特征在于，含有灭活后的权利要求1所述的Ⅰ群11d型禽腺病毒株。4.一种制备权利要求3所述的I群禽腺病毒灭活疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1所述的Ⅰ群11d型禽腺病毒株接种鸡胚或鸡肝癌细胞(LMH细胞)、收获病毒抗原液、灭活和乳化的步骤。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，具体步骤如下：1)病毒抗原液的制备a.病毒接种：将权利要求1所述的Ⅰ群11d型禽腺病毒株通过绒毛尿囊膜的途径按103.0～104.0ELD50/0.1ml接种于7日龄SPF鸡胚，0.2ml/胚，37℃孵化箱培养，定期观察，弃24h内死胚；b.收获病毒抗原液：取...

【专利技术属性】
技术研发人员：张贺伟，程相朝，张春杰，田文静，宋敏杰，张淼丹，
申请(专利权)人：洛阳职业技术学院，张贺伟，
类型：发明
国别省市：河南,41