具有CL2A接头的抗体-SN-38免疫缀合物制造技术

本发明专利技术涉及具有CL2A接头的抗体‑SN‑38免疫缀合物。本发明专利技术涉及用于制备蛋白质或肽的SN‑38缀合物，优选地抗体或抗原结合抗体片段的免疫缀合物的方法和组合物。更优选，使用CL2A接头，以每抗体或抗体片段1‑12个，更优选6个或更少，最优选1‑5个SN‑38部分将SN‑38附接于抗体或抗体片段。最优选，以大规模批次制备所述免疫缀合物，对反应方案进行各种修改以最优化大规模的收率和回收率。其它实施方案涉及使疾病治疗的功效最大化和使施用的副作用最小化的免疫缀合物的施用的最优化的剂量和/或方案。

ANTIBODY-SN-38 IMMUNOCONJUGATE WITH CL2A JOINTS

【技术实现步骤摘要】
具有CL2A接头的抗体-SN-38免疫缀合物相关申请本申请是国际申请日为2014年4月17日的国际申请PCT/US2014/034518、申请号为201480041766.2的题为“具有CL2A接头的抗体-SN-38免疫缀合物”的专利技术专利申请的分案申请。本申请要求2013年7月23日提交的美国专利申请系列第13/948,732号的优先权。序列表本申请含有已以ASCII格式电子方式提交的并且在此通过引用整体并入本文的序列表。2014年4月4日创建的所述ASCII拷贝称为IMM340WO2_SL.txt并且大小为60,597字节。
本专利技术涉及具有提高的靶向各种癌细胞、感染性疾病生物体的能力和/或用于治疗自身免疫性疾病的治疗性免疫缀合物，所述缀合物含有抗体部分和选自药物的喜树碱基团的药物部分。抗体与药物部分经由可增强治疗功效的细胞内可裂解的键联连接。最优选地，喜树碱是SN-38并且联接抗体与药物部分的接头是CL2A，如下文中所描述的。在具体的实施方案中，可以以提供最佳效率和最小毒性的特定施用剂量和/或方案施用免疫缀合物。本文中公开的用于人治疗用途的缀合有SN-38的抗体的施用的最佳剂量和方案显示一直不能从动物模型研究预测的意想不到的优越效能，从而允许有效治疗抗标准抗癌治疗(包括亲本化合物伊立替康(CPT-11))的癌症。
技术介绍
多年来，使用单克隆抗体(MAb)以将毒性药剂特异性递送至人癌症一直是特异性靶向药物治疗的领域的目标。肿瘤相关MAb与合适的毒性药剂的缀合物已被开发，但在癌症的治疗中喜忧参半，并且实际上几乎未应用于其它疾病，诸如感染性和自身免性疫疾病。毒性药剂最常见地是化疗药物，尽管也已将粒子辐射放射性核素或细菌或植物毒素缀合于MAb，特别地用于癌症的治疗(Sharkey和Goldenberg，CACancerJClin.2006年7-8月；56(4)：226-243)以及，更近以来，将放射性免疫缀合物用于某些感染性疾病的临床前治疗(Dadachova和Casadevall，QJNuclMedMolImaging2006；50(3)：193-204)。使用的MAb-化疗药物缀合物的有利方面是：(a)化疗药物本身在结构上已被明确确定；(b)使用已非常明确的缀合化学物质，通常在远离Mab抗原结合区的特定位点将化疗药物连接于MAb蛋白；(c)可比包括MAb和细胞或植物毒素的化学缀合物更加可重现地产生MAb-化疗药物缀合物，因此更容易进行商业开发且被监管机构批准；和(d)MAb-化疗药物缀合物的全身性毒性比放射性核素MAb缀合物低几个数量级。关于蛋白质-药物缀合物的早期工作表明，对于作为有用的治疗剂的蛋白质-药物缀合物，药物优选地在其已被内化至靶细胞时，以其最初形式被释放。Trouet等Proc.Natl.Acad.Sci.USA79：626-629(1982))显示在药物与抗体部分之间使用被溶酶体切割以释放完整药物的特定肽接头的有利方面。值得注意的是，已基于肿瘤内部的pH通常低于正常生理pH的观察(Willner等，美国专利5,708,146；Trail等(Science261：212-215(1993))，开发了使用温和的酸可裂解接头诸如含有腙的那些接头制备的MAb-化疗药物缀合物。第一个被批准的MAb-药物缀合物，吉姆单抗奥佐米星，在抗-CD33抗体(人源化P67.6)与高效的加利车霉素衍生物之间掺入了酸不稳定性腙键。Sievers等，JClinOncol.19：3244-3254(2001)；Hamann等，BioconjugateChem.13：47-58(2002)。在一些情况下，产生在化学治疗性药物与Mab之间具有还原不稳定性位阻二硫键的MAb-化疗药物缀合物(Liu等，ProcNatlAcadSciUSA93：8618-8623(1996))。然而，另一种可裂解的接头包括组织蛋白酶B不稳定性二肽间隔子，诸如Phe-Lys或Val-Cit，与Trouet等人的含有1至4个氨基酸的溶酶体不稳定性肽间隔子类似，其在药物与二肽之间额外掺入可折叠间隔子(Dubowchik等，BioconjugateChem.13：855-869(2002)；Firestone等，美国专利6,214,345B1；Doronina等，NatBiotechnol.21：778-784(2003))。后一方法也用于制备喜树碱的免疫缀合物(Walker等，BioorgMedChemLett.12：217-219(2002))。已被利用的另一种可裂解部分是掺入抗体与化疗药物之间的接头的酯键联。Gillimard和Saragovi已经发现，当将紫杉醇的酯缀合于抗-大鼠p75MAb，MC192或抗-人TrkAMAb，5C3时，发现缀合物显示出靶特异性毒性。Gillimard和Saragovi，CancerRes.61：694-699(2001)。抗体-药物缀合物设计的当前概念强调附接(使用只有在细胞内才被裂解的稳定键)于抗体的超毒性药物的用途。该方法已被用于设计超毒性药物诸如加利车霉素、单甲基澳瑞他汀-E(MMAE)和类美登素类的缀合物。虽然非常稳定的对MAb的键合导致在循环中的稳定性，但缀合物在肝、脾和肾中也被加工，从而在这些器官中释放毒性药物，并且在疾病治疗应用中潜在地减少治疗窗。虽然最近监管机构批准(brentuximabvedotin)用于霍奇金淋巴瘤以及批准(ado-曲妥单抗艾坦辛(ado-trastuzumabemtansine))用于难治性乳腺癌是令人鼓舞，但最大可施用剂量的加利车霉素缀合物在非霍奇金淋巴瘤中的治疗功效的不存在及其随后的不连续，以及用于AML的吉妥珠单抗奥佐米星的市场撤回指向在ADC中使用超毒性剂(ultratoxics)的局限性。本专利技术的缀合物具有比未缀合的或“裸露的”抗体或抗体片段更大的功效，虽然此类未缀合的抗体部分已在特定情况下被使用。在癌症中，例如，裸抗体已在淋巴瘤(和)、结直肠癌和其它癌症(和)、乳腺癌的治疗中，以及目前大量在临床开发(例如，依帕珠单抗、维妥珠单抗、米拉珠单抗)中发挥作用。在大多数这些情况下，临床使用已牵涉将这些裸露的或未缀合的抗体与其它治疗诸如化学治疗或放射治疗组合。CL2A接头用于将治疗药物诸如SN-38附接于抗体部分的用途已被公开(例如，美国专利第7,999,083和8,080,250号，实施例部分通过引用并入本文)。然而，存在对用于制备和使用CL2A和MAb-CL2A-SN-38缀合物的更加高效的方法(包括导致最大功效和最低毒性的最优化剂量方案)以及CL2A-SN-38和抗体-CL2A-SN-38缀合物的高效大规模生产的需要。
技术实现思路
本专利技术利用喜树碱诸如SN-38的抗体缀合物，相较于超毒性化学治疗剂如加利车霉素、美登素类或MMAE的亚纳摩尔至皮摩尔毒性，所述抗体缀合物在体外具有纳摩尔毒性。非超毒性的药物的使用允许使用不需要细胞内化来释放游离药物，而是允许药物的一定细胞外释放的抗体-药物接头。对于下文中描述的CL2A接头，50％的所缀合的药物在24小时内被释放，从而通过细胞外和细胞内释放其来增加药物的生物利用度。另外，相对无毒的药物的使用允许较高剂量的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产生具有如下结构的化合物CL2A‑SN‑38的方法，

【技术特征摘要】
2013.07.23 US 13/9487321.一种产生具有如下结构的化合物CL2A-SN-38的方法，所述方法包括进行如所显示的反应方案：所述方法还包括将SN-38与叔-丁基二甲基氯硅烷(TBDMS-Cl)反应以产生10-O-TBDMS-SN-38(中间体4)，其中在二氯甲烷溶剂中进行所述反应。2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括将10-O-TBDMS-SN-38(中间体4)与三光气和DMAP反应以产生10-O-TBDMS-SN-38-20-O-氯甲酸酯(反应性中间体5)，其中通过将三光气添加至含有中间体4的二氯甲烷反应混合物中进行所述反应，并且分批添加所述三光气以在大规模生产中减少放热反应并维持高反应收率。3.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括用庚烷沉淀Lys(MMT)-PABOH(中间体2)。4.根据权利要求3所述的方法，所述方法还包括测定所述沉淀的中间体2中的残留二乙胺，并且如果检测到二乙胺的存在，通过层析纯化所述沉淀。5.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括通过铜催化的环化加成反应将叠氮基-PEG-Lys(MMT)-PABO-CO-20-O-SN-38(中间体7)与MCC-炔(中间体8)反应以产生MCC-PEG-Lys(MMT)-PABO-CO-20-O-SN-38(中间体9)，其中进行所述反应14小时以提高产物收率。6.根据权利要求5所述的方法，其中首先通过硅胶层析纯化中间体9，随后用EDTA提取以除去铜。7.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括将CL2A-SN38的马来酰亚胺部分与蛋白质或肽反应以产生缀合有SN38的蛋白质或肽。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述马来酰亚胺部分与蛋白质或肽上的还原的巯基反应。9.根据权利要求7所述的方法，其中所述蛋白质或肽为抗体或抗原结合抗体片段并且所述缀合有SN-38的抗体或抗体片段为免疫缀合物。10.根据权利要求9所述的方法，所述方法还包括通过正切流动过滤(TFF)纯化所述免疫缀合物。11.根据权利要求9所述的方法，其中使用25至30个透析过滤体积的缓冲液，利用50,000道尔顿分子量截断值的膜进行所述TFF。12.根据权利要求11所述的方法，所述方法还包括在pH为6.0至7.0的Good氏生物缓冲液中配制所述免疫缀合物以及冷冻干燥所述免疫缀合物以进行贮存。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述Good氏生物缓冲液选自由以下组成的组：2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸(HEPES)和1,4-哌嗪二乙磺酸(PIPES)，pH在6-7的范围内，并且缓冲液浓度为10-100mM。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述缓冲液的pH在6.5至7的范围内。15.根据权利要求13所述的方法，其中所述缓冲液浓度为25mM。16.根据权利要求13所述的方法，其中所述缓冲液为25mMMES缓冲液，pH6.5。17.根据权利要求9所述的方法，其中所述抗体为双特异性抗体或单克隆抗体。18.根据权利要求9所述的方法，其中所述抗体片段选自由以下组成的组：F(ab′)2、F(ab)2、Fab′、Fab、Fv、scFv、单结构域抗体和IgG4抗体的半分子。19.根据权利要求9所述的方法，其中将所述抗体或抗体片段附接于1至12个拷贝的CL2A-SN38。20.根据权利要求9所述的方法，其中将所述抗体或抗体片段附接于6个拷贝的CL2A-SN38。21.根据权利要求9所述的方法，其中将所述抗体或抗体片段附接于1至5个拷贝的CL2A-SN38。22.根据权利要求9所述的方法，其中所述抗体为抗-癌抗体、抗-感染性疾病抗体或抗-自身免疫性疾病抗体。23.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：SV戈文丹，JB盖尔，NJ霍尔曼，DM戈登伯格，
申请(专利权)人：免疫医疗公司，
类型：发明
国别省市：美国,US