同时检测四种黄热病毒属病毒的GeXP的快速检测引物组、试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术属于病毒检测技术领域，公开了一种同时检测四种黄病毒属病毒的GeXP的快速检测引物组、试剂盒及其应用。本发明专利技术基于GeXP技术设计了四对特异性引物和一对通用引物，并在此基础上构建了多重PCR体系，能够同时检测出寨卡病毒、黄热病毒、登革病毒和西尼罗病毒，有效缩短检测时间，并且具有特异性强、灵敏度高、准确率高、方便高效等优点，对由这四种病毒引起的虫媒病毒性疾病的诊断和防控具有重要意义。

Rapid Detection of Four Yellow Fever Viruses with GeXP Primers, Kits and Their Applications

【技术实现步骤摘要】
同时检测四种黄热病毒属病毒的GeXP的快速检测引物组、试剂盒及其应用
本专利技术属于病毒检测
，具体涉及同时检测四种黄病毒属病毒的GeXP的快速检测引物组、试剂盒及其应用。
技术介绍
黄热病毒属病毒简称黄病毒，是黄病毒科的最大家族，包含8个血清学亚群，由70多种病毒构成，其中40多种病毒与人类疾病相关，包括登革病毒(DENV)、乙型脑炎病毒(JEV)、寨卡病毒(ZIKV)、蜱传脑炎病毒(TBEV)、西尼罗病毒(WNV)、Kujun病毒(KUN)和黄热病毒(YFV)等，其中大多数为虫媒病毒。这类病毒结构相似，大多数为有包膜的RNA病毒，能够在节肢动物体内增殖但对节肢动物不致病，可以通过昆虫叮咬传染给人或其他脊椎动物。寨卡病毒是一种新现虫媒黄病毒，近期在美洲爆发流行，并有向全球扩散的趋势，已成为国际关注的突发性公共卫生事件。ZIKA为单链RNA病毒。1947年，科学家在乌干达一只患病猴子体内分离出了ZIKV，而后又在尼日利亚地区人身上检测到该病毒。ZIKA病毒于2014年传入美国并呈现出扩大蔓延趋势，引起世界卫生组织高度重视，2016年，在我国确诊了ZIKV输入性感染病例。ZIKV对成人不会造成生命危险，感染后出现发烧、头疼、皮疹、关节疼痛和结膜炎等温和症状，但其与罕见的格林巴利综合征及新生儿小头症有关。由于寨卡病毒最近几年才发生大规模流行，之前并未引起人们重视，目前对寨卡病毒的认识还很缺乏，开发寨卡病毒感染早期诊断技术对我国寨卡疾病的防控，尤其对育龄妇女有效防止新生儿小头畸形具有重要的意义。黄热病毒基因组为不分节段的单股正链RNA，只有一个血清型。黄热病是由黄热病毒引起的急性传染病，蚊是主要传播媒介。黄热病分为城市型和丛林型两种，在非洲和南美洲热带地区性流行，WHO估计全球每年发病20万例，约3万例死亡，其中，90％以上发生在非洲。尽管目前我国至今尚无黄热病流行或者确诊病例的报告，但随着全球经济的发展，国际间人群交往日渐密切，全球一体化进程逐渐加速，使得黄热病毒通过各种传播媒介易在各个国家之间传播，而其一旦传入我国，将会对人群构成极大威胁。登革病毒是一种通过蚊媒传播引起急性发热性传染病的病毒，根据病毒基因结构的特征，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型共四型。登革病毒主要在亚洲、非洲和南美洲的热带、亚热带地区流行，感染登革病毒后主要引起症状较轻的登革热，但少数病例会出现登革出血热，甚至在不及时治疗的情况下出现死亡。由于登革热是一种蚊传播疾病，一旦某一地区发生，极容易传播扩散。登革热在全球100多个国家发生过，25亿人具有感染的风险，每年大约有5000万人感染登革热病毒。西尼罗病毒是近年来在全球广泛流行的一种鸟宿主虫媒病毒，以色列、法国、南非、阿尔及利亚和俄罗斯等国都有过暴发流行，但未引起广泛重视。1996年，该病毒袭击了罗马尼亚首都布加勒斯特，造成约400人发生脑炎、近40人死亡的严重后果，1999年，美国纽约暴发了西尼罗病毒感染，在随后的几年中，该病毒在美国广泛传播。目前，国内外对上述病毒的诊断方法，主要还是依靠血清学试验、组织培养和常规的PCR检测，其中，血清学试验和组织培养具有灵敏度低、免疫交叉反应以及周期长等缺点，虽然传统多重PCR能同时扩增出多个目的基因片段进而实现多种病毒的快速诊断，降低检测成本，但扩增过程中易受到目的基因模板的特性、引物浓度等因素的影响，导致扩增效率不一致，检测准确性低。GenomeLabGeXP将多重PCR技术和毛细管电泳技术相结合，由用于设计引物的GeXPeXpressionProfiler软件和用于结果分析GenomeLabTMGeXPGeneticAnalysisSystem毛细管电泳仪两部分组成。多重PCR是在同一个PCR反应体系中加上2对或2对以上的引物，并能同时扩增出相应多个核酸片段的PCR反应，该技术主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定、某些遗传病及癌基因的分型鉴定等。GeXP系统扩增采用荧光标记的通用引物和末端连接有通用引物序列的特异性嵌合引物相结合引发多重体系扩增。PCR产物经GeXP毛细管电泳分离，含有荧光标记的PCR产物经GeXP检测窗口检测，依据检测片段与标准分子片段迁移时间计算出扩增片段的长度，根据片段大小区分基因类型，荧光信号强度代表该分离片段的扩增含量，该系统很好地解决了传统多重PCR技术存在的扩增效率不一的问题。我国自加入WTO后，经国境口岸的人员和货物往来极其频繁，寨卡、黄热、登革、西尼罗等病毒随时都有可能被感染的人或蚊虫带入国内，且具有临床症状相似、传染快、易流行等特点，一旦发生，将严重威胁人们健康和社会安定，因此，为了有效防控上述虫媒病毒性疾病的发生与传播，在疾病发生早期实行快速诊断是非常重要的环节，并且，若能应用在出入境口岸，对来往人员和货物的病毒携带情况进行快速检测，防止病毒传入，将具有重大意义。目前，尚未有能够同时检测寨卡、黄热、登革、西尼罗四种病毒的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供同时检测四种黄病毒属病毒的GeXP的快速检测引物组、试剂盒及其应用，能够同时对寨卡病毒、黄热病毒、登革病毒和西尼罗病毒进行检测，可对四种虫媒病毒性疾病进行有效防控，保障人们健康和社会安定。本专利技术采用的技术方案如下：同时检测四种黄病毒属病毒的GeXP的快速检测引物组，包括四对特异性引物，分别是引物对ZK-F和ZK-R、DG-F和DG-R、YF-F和YF-R、WN-F和WN-R，分别对应序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.8的碱基序列。进一步地，同时检测四种黄病毒属病毒的GeXP的快速检测引物组，还包括一对通用引物，分别是G-F和G-R，分别对应序列表SEQ.ID.No.9至SEQ.ID.No.10的碱基序列。同时检测四种黄病毒属病毒的GeXP的快速检测试剂盒，包括PCRBuffer5×、25mMMgCl2、TaqPolymerasw、四对特异性引物、一对通用引物、ddH2O，所述四对特异性引物分别为引物对ZK-F和ZK-R、DG-F和DG-R、YF-F和YF-R、WN-F和WN-R，一对通用引物为G-F和G-R，分别对应序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.10的碱基序列。进一步地，引物对ZK-F和ZK-R、引物对DG-F和DG-R、引物对YF-F和YF-R、引物对WN-F和WN-R在PCR反应体系中对应的摩尔浓度均为10μM；所述通用引物G-F和G-R在PCR反应体系中的摩尔浓度为10μM。进一步地，同时检测四种黄病毒属病毒的GeXP的快速检测试剂盒，其PCR反应体系每管20μL，其中，PCRBuffer5×2μL、MgCl22μL、TaqPolymerasw0.35μL、四对特异性引物各2μL、通用引物2μL，ddH2O补足至20μL。同时检测四种黄病毒属病毒的GeXP的快速检测引物组或同时检测四种黄病毒属病毒的GeXP的快速检测试剂盒在检测黄热病毒、寨卡病毒、登革病毒和西尼罗病毒中的应用。综上所述，由于采用了上述技术方案，本专利技术的有益效果是：本专利技术基于GeXP技术设计了四对特异性引物和一对通用引物，并在此基础上构建了多重PCR体系，能够同时检测出寨卡病毒、黄热病毒、登革病毒和西尼罗病毒，有效缩短检测时间，并本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.同时检测四种黄病毒属病毒的GeXP的快速检测引物组，其特征在于，包括四对特异性引物，分别是引物对ZK‑F和ZK‑R、DG‑F和DG‑R、YF‑F和YF‑R、WN‑F和WN‑R，分别对应序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.8的碱基序列。

【技术特征摘要】
1.同时检测四种黄病毒属病毒的GeXP的快速检测引物组，其特征在于，包括四对特异性引物，分别是引物对ZK-F和ZK-R、DG-F和DG-R、YF-F和YF-R、WN-F和WN-R，分别对应序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.8的碱基序列。2.根据权利要求1所述的同时检测四种黄病毒属病毒的GeXP的快速检测引物组，其特征在于，还包括一对通用引物，分别是G-F和G-R，分别对应序列表SEQ.ID.No.9至SEQ.ID.No.10的碱基序列。3.同时检测四种黄病毒属病毒的GeXP的快速检测试剂盒，包括PCRBuffer5×、25mMMgCl2、TaqPolymerasw、四对特异性引物、一对通用引物、ddH2O，其特征在于，所述四对特异性引物分别为引物对ZK-F和ZK-R、DG-F和DG-R、YF-F和YF-R、WN-F和WN-R，一对通用引物为G-F和G-R，分别对应序列表SEQ.ID.No.1至SEQ....

【专利技术属性】
技术研发人员：田绿波，石莹，高国龙，樊学军，
申请(专利权)人：四川国际旅行卫生保健中心，
类型：发明
国别省市：四川,51