玉米类受体激酶基因ZmRLK7及其应用制造技术

本发明专利技术公开了玉米类受体激酶基因ZmRLK7及其应用，该发明专利技术提供了玉米类受体激酶基因ZmRLK7的序列及其在调节植株高度、生物量和产量中的作用，将该基因的表达量上调，将使植株矮小，生物量及产量降低；将该基因表达量下调，植株变大，生物量及产量提高，利用本发明专利技术可以培育一种高产玉米，为进一步为提高禾谷类作物产量提供基因资源。

ZmRLK7 Gene of Corn Receptor Kinase and Its Application

【技术实现步骤摘要】
玉米类受体激酶基因ZmRLK7及其应用
本专利技术涉及玉米类受体激酶基因ZmRLK7及其应用，涉及基因工程领域。
技术介绍
玉米既是重要的粮食作物，又是重要的饲料和工业原料，培育优良玉米品种、提高玉米单产在国民经济的发展中占有举足轻重的地位。玉米产量取决于单株产量和种植密度，而单株产量可以进一步剖分为穗粒数和单粒重。相对于其他复杂农艺性状，籽粒性状遗传力高，容易度量，既是遗传研究的模式性状，也是遗传改良的重要目标性状。玉米遗传资源丰富，然而存在于玉米中的丰富自然变异至今并未完全挖掘，控制重要农艺性状的遗传基础也未得到深入的阐明，采用连锁分析与全基因组关联分析方法挖掘影响籽粒性状的关键基因，并解析其功能和调控机制，构建相关的调控网络并应用于育种研究有重要的现实和理论意义。近年来，通过基因组比较分析或关联分析的方法，水稻中一批参与调控粒型与产量性状的基因陆续被克隆，其分子机制也相继被解析，而玉米中相关基因的研究较少。目前，通过同源克隆的方式，玉米中一些与水稻产量基因同源的基因已经被克隆和报道，并表现出与水稻中基因保守的功能。控制水稻粒型的GS3和GW2基因在玉米中的同源基因已经被克隆，且两个基因与玉米籽粒粒型发育和粒重显著正相关。玉米Mn1和ZmINCW1为水稻灌浆基因OsGIF1的两个同源基因，Mn1基因的过表达增加了玉米籽粒产量，而将玉米ZmINCW1基因转化拟南芥AtcwINV2(拟南芥中ZmINCW1同源基因)突变体，可以互补其千粒重降低的表型，使种子产量增加。对玉米中与这些产量相关的基因的开发为高产玉米的培养提供基因资源。但是上述相关基因多是对某一种玉米性状有较好的影响，而开发对多种产量相关性状均具有良好影响的基因，无论是对提高育种效率，还是对提高经济效益均具有优质意义。
技术实现思路
本专利技术克服了上述现有技术的不足，提供玉米类受体激酶基因ZmRLK7及其应用，ZmRLK7基因是基于表达数量性状基因座(expressionquantitativetraitloci,eQTL)分析方法获得的，将该基因的表达量上调，将使植株矮小，生物量及产量降低；将该基因表达量下调，植株变大，生物量及产量提高。玉米类受体激酶基因ZmRLK7，其核苷酸序列如SEQ1所示。进一步的，编码上述玉米类受体激酶基因ZmRLK7的氨基酸序列如SEQ2所示。进一步的，上述玉米类受体激酶基因ZmRLK7位于第7染色体的调控热点区域，是一个富亮氨酸重复的类受体蛋白激酶基因。拟南芥中与野生型相比，转正义ZmRLK7基因拟南芥植株矮小，转反义基因拟南芥植株增大。本专利技术还提供含有上述玉米的类受体激酶基因ZmRLK7的重组表达载体。进一步的，所述重组表达载体包含玉米类受体激酶基因ZmRLK7片段，将所述基因片段通过KpnI酶切位点连接到载体pCAMBIA3301中，鉴定正反向，得到玉米Ubiquitin启动子分别驱动正反向基因表达的重组质粒PUbi::Sense-ZmRLK7和PUbi::Antisense-ZmRLK7。所述重组表达载体用于玉米ZmRLK7基因的过量表达、反义抑制、RNA干扰和CRISPR/Cas9基因编辑。上述类受体激酶基因ZmRLK7或上述的重组表达载体在提高植物植株高度、增加植株生物量和提高种子产量中的应用。上述类受体激酶基因ZmRLK7或上述的重组表达载体在获得高产玉米中的应用。本专利技术还提供一种提高植物植株高度、增加植株生物量和提高种子产量的方法，包括如下步骤：S1载体构建：扩增基因ZmRLK7全长编码区，扩增片段测序正确后，将该基因片段通过KpnI酶切位点连接到载体pCAMBIA3301中，鉴定正反向后选取获得玉米Ubiquitin启动子驱动的反向基因表达的重组质粒PUbi::Antisense-ZmRLK7；S2农杆菌转化：将步骤S1中所述的反向基因表达的重组质粒转化AGL1农杆菌感受态细胞中；S3植株转化：将含有步骤S2获得的重组质粒的农杆菌转接到YEP液体培养基中收集培养后的菌体，使用浸花法将菌体转化入拟南芥中成熟期收获种子获得转基因T1代种子，或通过上述农杆菌介导玉米幼胚遗传转化获得转基因玉米植株。有益效果：本专利技术揭示了玉米类受体激酶基因ZmRLK7的序列及其在调节植株高度、生物量和产量中的作用，利用该基因可以调控拟南芥、烟草、玉米等植物的生长发育及其综合抗性。该基因的表达量上升，使植株矮小，生物量及产量降低；该基因表达量下降，植株变大，生物量及产量提高。利用本专利技术可以培育一种高产玉米，为进一步为提高禾谷类作物产量提供基因资源。附图说明图1基因克隆与载体鉴定图。图2农杆菌转化鉴定图。图3农杆菌介导遗传玉米幼胚遗传转化过程图。图4转基因玉米鉴定图。图5基因表达模式图。图6转基因拟南芥表型图。图7转基因玉米籽粒表型统计图。图8转基因玉米植株表型图。图9ZmRLK7基因亚细胞定位图。具体实施方式实施例1含有类受体激酶基因ZmRLK7的表达载体的构建1、构建表达载体实验所用植物转化双元载体为改造的pCAMBIA3301，该质粒携带草铵膦抗性基因Bar。以玉米B73cDNA为模板，以RLK7-F:5′-GGTACCTAGTACAAACAATTCATGGGGTCT-3′(SEQIDNo.3)和RLK7-R:5′-GGTACCAAGGCTGCTACAAAAACCGACATT-3′(SEQIDNo.4)为引物，利用高保真酶扩增ZmRLK7全长编码区，下划线部分为限制性内切酶KpnI酶切位点。PCR反应体系为25μl，包括如下组分：2×High-fidelityMasterMix12.5μl，上下游引物(浓度10μM)各1μl，cDNA2μl，加灭菌水8.5μl。PCR程序为：98℃预变性1min；98℃变性10s，68℃退火15s，72℃延伸45s，循环35次；72℃过度延伸5min。扩增片段测序正确后，通过KpnI酶切位点连接到载体pCAMBIA3301中，鉴定正反向，得到玉米Ubiquitin启动子分别驱动正反向基因表达的重组质粒PUbi::Sense-ZmRLK7与PUbi::Antisense-ZmRLK7。图1为构建成功的载体酶切结果，如图所示，用BamHI、PstI对质粒进行酶切时，分别获得1.2Kb+大带和3.7Kb+大带的条带时即为连入Sense-ZmRLK7；分别获得2.2Kb+1.2Kb+631bp+410bp+大带和2.6Kb+2Kb+701bp+520bp+大带的条带时即为连入Antisense-ZmRLK7。2、转化农杆菌感受态将以上重组质粒转化AGL1农杆菌感受态细胞，方法参考感受态说明书。取-70℃保存的农杆菌感受态细胞于冰浴中融化，向100μl感受态细胞中加入1μg重组质粒，轻轻混匀，冰浴30min后，液氮速冻5min；然后置于37℃水浴中孵育5min，冰浴2min；加入800μlYEP(酵母膏；10g·L-1胰蛋白胨；5g·L-1氯化钠；PH7.0)液体培养基，并于28℃摇床上振荡培养2-3h。收集菌体后，涂布于含有卡那霉素和利福平的YEP平板上，于28℃培养箱中倒置培养48-72h。培养72h后，挑单克隆摇菌提质粒，分别用引物UBQ1Forward:CTTTTTGTTCGCTTG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.玉米类受体激酶基因ZmRLK7，其特征在于，核苷酸序列如SEQ1所示。

【技术特征摘要】
1.玉米类受体激酶基因ZmRLK7，其特征在于，核苷酸序列如SEQ1所示。2.如权利要求1所述的玉米类受体激酶基因ZmRLK7，其特征在于，编码所述玉米类受体激酶基因ZmRLK7的氨基酸序列如SEQ2所示。3.如权利要求1所述的玉米类受体激酶基因ZmRLK7，其特征在于，所述玉米类受体激酶基因ZmRLK7位于第7染色体的调控热点区域，是一个富亮氨酸重复的类受体蛋白激酶基因。4.含有如权利要求1所述的玉米的类受体激酶基因ZmRLK7的重组表达载体。5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，将玉米类受体激酶基因ZmRLK7片段通过KpnI酶切位点连接到载体pCAMBIA3301中，鉴定正反向后，得到玉米Ubiquitin启动子分别驱动正反向基因表达的重组质粒PUbi::Sense-ZmRLK7和PUbi::Antisense-ZmRLK7。6.如权利要求4或5所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体用于玉米ZmRLK7基因的过量表达、反义抑制、RNA干扰和CRISPR/Cas9基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：何春梅，汪黎明，王娟，关海英，刘铁山，刘强，刘春晓，董瑞，
申请(专利权)人：山东省农业科学院玉米研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37