AXMI115变体灭虫基因及其使用方法技术

提供了赋予细菌、植物、植物细胞、组织和种子杀虫活性的组合物和方法。毒素编码序列可以用于DNA构建体或表达盒中以在植物和细菌中表达。组合物还包括转化的细菌、植物、植物细胞、组织和种子。具体地，提供了多聚核苷酸序列以及由此所编码的毒素蛋白。还提供了与那些氨基酸序列特异性结合的抗体。具体地，本发明专利技术包括编码融合蛋白的核苷酸序列及其生物学活性变体和片段，其中所述融合蛋白含有SEQ ID NO:43的C末端部分。融合蛋白还可以含有SEQ ID NO:45的N末端部分。本发明专利技术还包括SEQ ID NO:47和1‑14的核苷酸序列，或编码SEQ ID NO:48和15‑31中所示氨基酸序列的核苷酸序列，包括其生物学活性变体和片段。

AXMI115 mutant insecticidal gene and its application

【技术实现步骤摘要】
AXMI115变体灭虫基因及其使用方法本申请是2012年4月4日提交的申请号为CN201280027517.9、专利技术名称为“AXMI115变体灭虫基因及其使用方法”的中国申请的分案。相关申请的交叉引用本申请要求2011年4月5日提交的美国第61/471848号临时申请的优先权，其内容作为整体通过引用并入本文。电子提交的序列表的引用序列表的官方文本以ASCII格式通过EFS-Web电子提交，其文件名称为“2916693-093977-SEQLIST.txt”，创建于2012年4月2日，大小为241千比特，并且与说明书同时提交。该ASCII格式的文件含有的序列表是说明书的一部分，并且作为整体通过引用并入本文。专利
本专利技术涉及分子生物学领域。提供了编码杀虫(pesticidal)蛋白的新基因。这些蛋白和编码它们的核酸序列可以用于制备杀虫制剂以及生产抗害虫转基因植物。专利技术背景苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensi)是革兰氏阳性产孢子土壤细菌，其特征在于能够产生针对某些昆虫目和种具有特异性毒性，但是对植物和其它非靶标有机体却无害的晶状包涵体。由此，包含苏云金芽孢杆菌菌株或其灭虫(insecticidal)蛋白的组合物可用作环境可接受的灭虫剂，以控制农业害虫或引起多种人或动物疾病的昆虫媒介。来自于苏云金芽孢杆菌的晶体(Cry)蛋白(δ-内毒素)具有主要针对鳞翅目(Lepidopteran)、半翅目(Hemipteran)、双翅目(Dipteran)和鞘翅目(Coleopteran)幼虫的强效灭虫活性。这些蛋白还显示出针对膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)、虱毛目(Phthiraptera)、食毛目(Mallophaga)和蜱螨目(Acari)害虫以及其它无脊椎动物(例如线形动物门(Nemathelminthes)、扁形动物门(Platyhelminthes)和Sarcomastigorphora的活性(Feitelson(1993)TheBacillusThuringiensisfamilytree.InAdvancedEngineeredPesticides,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.)。该晶体蛋白直到被摄取并且溶解于昆虫中肠内才表现出灭虫活性。摄取的原毒素在昆虫消化道中被蛋白酶水解成具有活性的毒素分子(andWhiteley(1989)Microbiol.Rev.53:242-255)。该毒素在靶标幼虫的中肠内结合到顶端刷状缘受体上，并插入到顶膜中，产生离子通道或孔道，从而导致幼虫死亡。除了内毒素之外，苏云金芽孢杆菌在其营养生长期还产生分泌的灭虫蛋白，即营养期杀虫蛋白(Vip)。自从发现第一种Vip毒素以来，在苏云金芽孢杆菌中已经鉴定出了两个主要类型的Vip毒素。一类Vip毒素由毒素双体组成，所述毒素双体由两种组分Vip1和Vip2构成(Warren(1997)InN.B.CarozziandM.G.Koziel(ed.),Advancesininsectcontrol:theroleoftransgenicplants.Taylor&Francis,London,UnitedKingdom)。Vip1和Vip2的组合对农业上重要的昆虫西部玉米根虫(Diabroticavirgifera)具有高度的灭虫活性，但是对任何鳞翅目昆虫却未表现出任何杀虫活性(Hanetal.(1999)Nat.Struct.Biol.6:932-936)。另一类由Vip3毒素组成，其与Vip1或Vip2没有序列相似性。首个被鉴定的Vip3毒素Vip3Aa1对玉米和棉花的几种主要鳞翅目害虫，包括秋天行军虫草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)和棉铃虫谷实夜蛾(Helicoverpazea)，具有高度的灭虫活性，但对玉米的一种主要害虫欧洲玉米螟(Ostrinianubilalis)却未显示出活性(Estruchetal.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:5389-5394)。从苏云金芽孢杆菌菌株中删除vip3Aa1基因导致该苏云金芽孢杆菌菌株的灭虫活性显著降低，表明Vip3贡献了苏云金芽孢杆菌菌株总体毒性(Donovanetal.(2001)J.Invertebr.Pathol.78:45-51)。还观察到Vip3Aal通过形成细胞膜孔(Leeetal.(2003)Appl.Environ.Microbiol.69:4648-4657)使昆虫中肠细胞裂解(Yuetal.(1997)Appl.Environ.Microbiol.63:532-536)而杀死昆虫。基于苏云金芽孢杆菌的灭虫剂的集中使用已经使小菜蛾(Plutellaxylostella)的田间种群的抗性增强(FerréandVanRie(2002)Annu.Rev.Entomol.47:501-533)。最常见的抗性机制是毒素与其特异性中肠受体的结合减少。这可能也会赋予对共用相同受体的其它毒素的交叉抗性(FerréandVanRie(2002))。专利技术概述提供了赋予细菌、植物、植物细胞、组织和种子杀虫活性的组合物和方法。组合物包含编码杀虫和灭虫多肽序列的核酸分子、含有该些核酸分子的载体，以及含有该些载体的宿主细胞。组合物还包含杀虫多肽序列和该些多肽的抗体。核苷酸序列可用于DNA构建体和表达盒中，以进行转化和在有机体(包括微生物和植物)中表达。核苷酸或氨基酸序列可以是已经设计用于在有机体(包括但不限于微生物或植物)中表达的合成序列。组合物还包含含有本专利技术核苷酸序列的细菌、植物、植物细胞、组织和种子。具体地，提供了编码杀虫蛋白的分离的核酸分子。此外，还包括对应于杀虫蛋白的氨基酸序列。具体地，本专利技术提供了包含编码融合蛋白的核苷酸序列的分离或重组的核酸分子及其生物学活性变体和片段，其中所述融合蛋白包含SEQIDNO:43的C末端部分。在多个实施方案式中，融合蛋白包含SEQIDNO:45的N末端部分。在特定的实施方案中，本专利技术所包括的核酸分子(包括含有核酸分子的载体、宿主细胞、植物和种子)包括SEQIDNO:47和1-14中所示的核苷酸序列，或编码SEQIDNO:48和15-31中所示氨基酸序列的核苷酸序列，包括其生物学活性变体和片段。还包括与本专利技术核苷酸序列互补的，或与本专利技术序列或其互补序列相杂交的核苷酸序列。本文中还包括由本专利技术核酸分子编码的分离或重组的融合蛋白。提供了产生本专利技术的多肽的方法，以及利用那些多肽控制或杀死鳞翅目、半翅目、鞘翅目、线虫类(nematode)或双翅目害虫的方法。还包括用于检测样品中本专利技术核酸和多肽的方法和试剂盒。本专利技术的组合物和方法有利于生产具有增强的抗虫性或耐虫性的有机体。这些有机体以及包含有机体的组合物期望用于农业。本专利技术的组合物还有利于生产具有杀虫活性的经改变或改良的蛋白，或者用于检测产品或有机体中杀虫蛋白或核酸的存在。附图简述图1显示融合构建体的图示图2显示体外叶盘(leafdisk)生物测定的结果。pAG6585含有optAxmi115v01(N＝14)，pAG6141含有optAxmi115v02.0本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组核酸分子，含有编码具有杀虫活性的多肽的核苷酸序列，其中该核苷酸序列选自：a)如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；b)编码包含如SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；以及c)编码包含有相对于SEQ ID NO:21所示氨基酸具有1至5个氨基酸取代、缺失或插入的多肽的核苷酸序列，其中该多肽的杀虫活性优于SEQ ID NO:43多肽。

【技术特征摘要】
2011.04.05 US 61/471,8481.一种重组核酸分子，含有编码具有杀虫活性的多肽的核苷酸序列，其中该核苷酸序列选自：a)如SEQIDNO:7所示的核苷酸序列；b)编码包含如SEQIDNO:21所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；以及c)编码包含有相对于SEQIDNO:21所示氨基酸具有1至5个氨基酸取代、缺失或插入的多肽的核苷酸序列，其中该多肽的杀虫活性优于SEQIDNO:43多肽。2.如权利要求1所述的重组核酸分子，其中该核苷酸序列选自：a)如SEQIDNO:7所示的核苷酸序列；以及b)编码包含如SEQIDNO:21所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。3.如权利要求1所述的重组核酸分子，其中该核苷酸序列是设计用于在植物中表达的合成序列。4.如权利要求1所述的重组核酸分子，其中该核苷酸序列与能够指导所述核苷酸序列在植物细胞中表达的启动子可操作性连接。5.一种载体，包含权利要求1所述的重组核酸分子。6.权利要求5所述的载体，其进一步包含编码异源多肽的核酸分子。7.一种宿主细胞，其含有权利要求1所述的重组核酸分子。8.如权利要求7所述的宿主细胞，其为细菌宿主细胞。9.如权利要求7所述的宿主细胞，其为植物宿主细胞。10.一种转基因植物，其包含权利要求9所述的宿主细胞。11.如权利要求10所述的转基因植物，其中，其选自玉米、高梁、小麦、卷心菜、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦、和油菜。12.一种转基因种子，其含有权利要求1所述的重组核酸分子。13.一种重组多肽，其具有杀虫活性，其中，该多肽包含选自以下的氨基酸序列：a)如SEQIDNO:21所示的氨基酸序列；以及b)包含有相对于SEQIDNO:21所示氨基酸具有1至5个氨基酸取代、缺失或插入的氨基酸序列，其中该多肽的杀虫活性优于SEQIDNO:43多肽。14.如权利要求13所述的重组多肽，其中，该多肽包含SEQIDNO:21。15.如权利要求13所述的多肽，还包含异源氨基酸序列。16.一种组合物，其包含权利要求13所述的重组多肽。17.如权利要求16所述的组合物，其中该组合物选自粉剂、尘剂、丸剂、粒剂、丸剂、喷雾剂、乳剂、胶体和溶液。18.如权利要求16所述的组合物，其中所述组合物通过对细菌细胞培养物进行干燥、冻干、匀质化、提取、过滤、离心、沉淀或浓缩而制备。19.如权利要求16所述的组合物，其包含约1重量％至约99重量％的所述重组多肽。20.一种用于控制鳞翅目、半翅目、鞘翅目、线虫类或双翅目害虫群的方法，其包括使所述害虫群与杀虫有效量的权...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·莱特宁，N·M·德塞，V·海恩瑞奇斯，
申请(专利权)人：阿森尼克斯公司，
类型：发明
国别省市：美国,US