一种人工改造自然杀伤性细胞及其制备与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种利用糖化学修饰方法获得的人工改造自然杀伤性(NK)细胞，及其制备工艺与应用。本发明专利技术通过糖代谢途径，将人工合成的具备肿瘤靶向功能，且能有效阻断肿瘤细胞表面PD‑L1受体的核酸适配体，通过点击化学方式，共价偶联于NK细胞表面，形成具备肿瘤靶向杀伤功能，且有效阻断免疫检查点PD‑L1的人工改造的NK细胞，用于肿瘤的过继性免疫治疗，有效提高肿瘤免疫治疗效果，具备良好的临床转化价值。

An Artificially Modified Natural Killer Cell and Its Preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种人工改造自然杀伤性细胞及其制备与应用(一)
本专利技术涉及一种人工改造自然杀伤性细胞及其制备方法，及其在过继性免疫治疗中应用。(二)
技术介绍
我国是肝癌大国，全球每年新增发病的肝癌患者中有一半来自中国，其发病率呈逐年上升趋势，其中，肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)是常见的肝癌类型之一，具有快增殖，高复发，易转移等特征，严重我国乃至人类的健康。而基于手术治疗的开放性治疗方式，会因患者的肿瘤占位及身体耐受性等影响而失去最佳治疗时机，而放、化疗作为一种辅助治疗方式，无法有效抑制肿瘤细胞生长，且对机体产生较大的毒副作用。而近年来，基于免疫细胞而发展起来的过继性免疫治疗策略，其具有毒副作用低，作用效果明显，可有效抑制肿瘤生长等优势，为肝癌治疗提供了新的思路与策略。基于免疫细胞的过继性免疫治疗(adoptiveimmunotherapy)，已经成为现今临床免疫治疗热点。其中，CAR-T和CAR-NK细胞免疫疗法受到业界普遍关注，并投入巨大的科研与开发资金。自2016年，包括中国在内的多个国家的不同临床研究机构同时开展了多个有关CAR-T和CAR-NK细胞免疫疗临床试验。相比于CAR-T，CAR-NK具有良好的靶向自然杀伤功能，其具备识别与溶解病毒感染细胞及肿瘤细胞；可产生免疫调节性细胞因子用以提高人体免疫系统的防御及抵抗外界细菌，病毒及肿瘤侵润能力。在开发NK细胞疗法的生物技术公司中，位于美国洛杉矶的NantKwest公司开发最为著名。2017年3月，该公司针对默克尔细胞癌的活化NK细胞疗法刚被FDA授予孤儿药。然而，CAR-NK的制备工艺较为复杂，制备成本高，转染效率低，以及病毒转染后产生的生物安全性等，仍然是CAR-NK免疫治疗策略的巨大挑战。近年来，基于糖代谢途径及生物化学等交叉学科发展，已广发应用于临床前基础研究领域，并显示出较为广阔的生物医学应用前景。其中，叠氮修饰甘露糖(Ac4ManNAz)可有效的被细胞摄取，并通过糖代谢途径在其细胞表面表达出叠氮键，通过点击化学方式，可以与不同带有DBCO末端的小分子结合，用于细胞表面的功能化修饰，此过程简单易操作，且生物安全性高，无细胞毒副作用，为人工改造细胞提供新策略。此外，与靶向抗体相比，基于SELEX技术即指数富集的配体系统进化技术而筛选出的核酸适配体，除具备良好的肿瘤靶向功能外，其合成成本低廉，易化学及功能化修饰，无免疫源性，热稳定性高特点，具有广阔的生物医学应用前景。其中，谭蔚泓院士筛选的TLS11a核酸适配体，具有对人源肝癌良好的靶向功能，已用于多项临床前基础应用研究。此外，Pan-ChyrYang等筛选的PD-L1核酸适配体，具备良好的人源肿瘤细胞表面PD-L1受体结合，有效阻断肿瘤细胞表面PD-L1受体，提高免疫治疗。虽然寡核酸适配体能够靶向小鼠体内的肿瘤，但其靶向及抑制效果有效，且核酸在体内循环过程中，易被核酸酶降解，且体内稳定性差。(三)
技术实现思路
为了解决上述技术难题，开发稳定核酸适配体的技术手段，本专利技术一种人工改造自然杀伤性细胞及其制备方法，及其在过继性免疫治疗中应用。本专利技术采用的技术方案是：一种人工改造自然杀伤性(NK)细胞，由白细胞介素-2激活的NK细胞与叠氮修饰的甘露糖共培养，通过糖代谢途径在NK细胞表面表达叠氮键获得糖处理后的激活的NK细胞，再将人工合成的DBCO化学分子末端修饰的TLS11a/PD-L1核酸适配体，通过点击化学手段，共价偶联于糖处理后的激活的NK细胞表面获得。具体的，所述人工改造自然杀伤性细胞由如下方法制备获得：(1)通过健康人外周血液中提取NK细胞并用白细胞介素-2激活；(2)白细胞介素-2激活后的NK细胞与叠氮修饰的甘露糖共培养，在NK细胞表面表达叠氮键获得糖处理后的激活的NK细胞；(3)将人工合成的DBCO修饰的TLS11a及PD-L1核酸适配体与糖处理后的激活的NK细胞共培养，获得所述人工改造自然杀伤性细胞。DBCO末端修饰的TLS11a序列如下：DBCO-ACAGCATCCCCATGTGAACAATCGCATTGTGATTGTTACGGTTTCCGCCTCATGGACGTGCTG；DBCO末端修饰的PD-L1序列如下：DBCO-ACGGGCCACATCAACTCATTGATAGACAATGCGTCCACTGCCCGT。本专利技术的通过糖代谢途径，将人工合成的DBCO化学分子末端修饰的TLS11a/PD-L1核酸适配体，通过点击化学手段，将其共价偶联于激活的NK细胞表面，成功构建具备多价态核酸适配体，生物体内稳定性高，生物相容性良好，具备肝癌靶向性及PD-L1阻断功能的人工改造NK细胞，用于肝癌的靶向过继性免疫治疗，具有较好应用前景。本专利技术还涉及一种制备所述的人工改造自然杀伤性细胞的方法，所述方法如下：(1)采集健康人外周血液，用无菌生理盐水稀释，采用等密度梯度离心获得PBMC细胞，用KBM581培养基调节细胞密度为1～3×106个/mL，然后用辐射的工程化IL-21NK细胞作为饲养细胞，与PBMC在含有重组人IL-2的培养基中共培养；将NK细胞维持在37℃，5％CO2培养箱中培养，应在第3天开始补充培养基及相关细胞因子，并且每次添加的培养液体积不超过现有体积的一倍，相关细胞因子为重组人IL-2，庆大霉素。(2)NK细胞培养至第7天，调整NK细胞密度为0.5～1.5×106个/ml，再次添加饲养细胞与NK细胞共培养，培养第12～14天收获激活的NK细胞；(3)激活的NK细胞加入含叠氮修饰的甘露糖的培养基继续培养24～48小时，采用D-PBS清洗NK细胞，再添加人工合成的DBCO末端修饰的TLS11a和DBCO末端修饰的TLS11a的两条单链核酸适配体，使激活的NK细胞表面共价偶联TLS11a和PD-L1核酸适配体，获得所述人工改造自然杀伤性细胞。DBCO末端修饰的TLS11a序列如下：DBCO-ACAGCATCCCCATGTGAACAATCGCATTGTGATTGTTACGGTTTCCGCCTCATGGACGTGCTG；DBCO末端修饰的PD-L1序列如下：DBCO-ACGGGCCACATCAACTCATTGATAGACAATGCGTCCACTGCCCGT。本专利技术通过上述步骤利用细胞饲养法制备自然杀伤性NK细胞，然后通过NK细胞摄取叠氮修饰甘露糖(Ac4ManNAz)，通过糖代谢途径在NK细胞表面表达叠氮键，并将人工合成的DBCO分子末端修饰的TLS11a和PD-L1核酸适配体，通过点击化学手段共价偶联于激活的NK细胞表面。本专利技术制备得到的人工改造自然杀伤性(NK)细胞可通过核酸适配体TLS11a靶向肝癌细胞(HepG2，H22)，提高NK细胞识别肿瘤细胞的能力；同时，核酸适配体PD-L1能够阻断癌细胞表面的PD-L1受体，进一步阻断其与NK细胞表面PD-1配体的结合，进一步提高NK细胞对肿瘤细胞的杀伤。步骤(1)中所述含有重组人IL-2的培养基组成如下：庆大霉素50～160IU/mL，重组人IL-2200～1000IU/mL，自体血浆1％～5％，溶剂为KBM581无血清培养基。外周血PBMC细胞可通过等密度梯度离心方法制备获得，具体如下：将全血与生理盐水等体积本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人工改造自然杀伤性(NK)细胞，由白细胞介素‑2激活的NK细胞与叠氮修饰的甘露糖共培养，通过糖代谢途径在NK细胞表面表达叠氮键获得糖处理后的激活的NK细胞，再将人工合成的DBCO化学分子末端修饰的TLS11a/PD‑L1核酸适配体，通过点击化学手段，共价偶联于糖处理后的激活的NK细胞表面获得。

【技术特征摘要】
1.一种人工改造自然杀伤性(NK)细胞，由白细胞介素-2激活的NK细胞与叠氮修饰的甘露糖共培养，通过糖代谢途径在NK细胞表面表达叠氮键获得糖处理后的激活的NK细胞，再将人工合成的DBCO化学分子末端修饰的TLS11a/PD-L1核酸适配体，通过点击化学手段，共价偶联于糖处理后的激活的NK细胞表面获得。2.如权利要求1所述的人工改造自然杀伤性细胞，其特征在于所述人工改造自然杀伤性细胞由如下方法制备获得：(1)通过健康人外周血液中提取NK细胞并用白细胞介素-2激活；(2)白细胞介素-2激活后的NK细胞与叠氮修饰的甘露糖共培养，在NK细胞表面表达叠氮键获得糖处理后的激活的NK细胞；(3)将人工合成的DBCO修饰的TLS11a及PD-L1核酸适配体与糖处理后的激活的NK细胞共培养，获得所述人工改造自然杀伤性细胞。3.如权利要求2所述的人工改造自然杀伤性细胞，其特征在于：DBCO末端修饰的TLS11a序列如下：DBCO-ACAGCATCCCCATGTGAACAATCGCATTGTGATTGTTACGGTTTCCGCCTCATGGACGTGCTG；DBCO末端修饰的PD-L1序列如下：DBCO-ACGGGCCACATCAACTCATTGATAGACAATGCGTCCACTGCCCGT。4.一种制备权利要求1所述的人工改造自然杀伤性细胞的方法，其特征在于所述方法如下：(1)采集健康人外周血液，用无菌生理盐水稀释，采用等密度梯度离心获得PBMC细胞，用KBM581培养基调节细胞密度为1～3×106个/mL，然后用辐射的工程化IL-21NK细胞作为饲养细胞，与PBMC在含有重组人IL-2的培养基中共培...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘小龙，张达，郑友世，蔡志雄，苏小平，
申请(专利权)人：上海瑞可新生物科技有限公司，格源致善上海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31