一种利用盘羊睾丸组织精子体外生产胚胎的方法技术

本发明专利技术属于动物繁育领域，具体涉及一种利用盘羊睾丸组织精子体外生产胚胎的方法。该方法包括离体盘羊睾丸组织的冷冻保存，冷冻盘羊睾丸组织中精子分离，绵羊卵母细胞体外培养成熟，胞浆单精子注射ICSI，ICSI胚胎体外培养等步骤。本发明专利技术中所涉及的睾丸组织精子分离技术操作简单省时，不需要考虑杂细胞、精子数量和活力的因素，填补了利用盘羊睾丸组织精子体外生产胚胎技术的空白。

A Method of Producing Embryos in Vitro Using Sperm from Testicular Tissue of Pansheep

【技术实现步骤摘要】
一种利用盘羊睾丸组织精子体外生产胚胎的方法
本专利技术属于动物繁育领域，具体涉及一种利用盘羊睾丸组织精子体外生产胚胎的方法。
技术介绍
优良的种质资源是牧业生产的重要项目，优良的种质资源是否能大量繁育决定着牧业经济效益的高低。以盘羊的繁育工作为例，盘羊野性大，主要分布于青海甘肃境内，属国家二级保护动物。盘羊具备适合做肉羊亲本的体型优势，且盘羊肉脂肪含量低、瘦肉率高、味道鲜美。利用野生盘羊优良的肉用性能优势对现有藏系绵羊品种进行杂交改良，培育适应青藏高原特殊生态环境、具有优秀肉用性能的绵羊新品系，会极大地促进高原农业动物种质创新。现有技术中，制约优良品种动物繁育的重要原因是该品种胚胎供体数量不足，也就是说，优良品种动物数量本身不足，因此依靠自然交配方式进行繁育不能满足牧业生产需求。为了改变原有品种的生长特性，使优良品种动物数量增加，促进牧业的经济发展，需要开发一种盘羊睾丸组织精子生产体外胚胎的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用盘羊睾丸组织精子体外生产胚胎的方法，通过胞浆单精子注射(IntracytoplasmicSpermInjection，ICSI)技术体外生产盘羊-绵羊杂交胚胎，能使优良品种动物数量增加，促进牧业的经济发展。本专利技术提供的一种利用盘羊睾丸组织精子体外生产胚胎的方法，包括以下步骤：S1，离体盘羊睾丸组织的冷冻保存，备用将离体的盘羊睾丸组织剥去外膜后，将睾丸实质部分剪碎并置于含冻存液的冻存管中，4℃放置2-3h后投入液氮中长期冷冻保存，备用；S2，冷冻盘羊睾丸组织中精子分离将液氮中冻存的盘羊睾丸组织取出，置于37℃水浴中解冻，将解冻的睾丸组织混匀后离心，弃上清，并用羊精子上浮液液清洗沉淀，最后将沉淀用羊精子上浮液液悬浮，制成精子悬液，备用；S3，绵羊卵母细胞体外培养成熟从离体的绵羊卵巢采集卵丘卵母细胞复合体，并培养至排出第一极体，得到含有第一极体的成熟卵母细胞，备用；S4，胞浆单精子注射ICSI准备ICSI注射盘：用羊精子上浮液液分别配制12g/100mL、6g/100mL聚乙烯吡咯烷酮溶液，取容器作为ICSI注射盘，在ICSI注射盘上分别制作羊精子上浮液液注射滴、12g/100mL聚乙烯吡咯烷酮滴、6g/100mL聚乙烯吡咯烷酮滴和S2的精子悬液滴，每个液滴上覆石蜡油；ICSI操作：取熟卵母细胞置于羊精子上浮液液注射滴中，将ICSI注射盘置于37℃恒温板的显微镜下，在4倍镜下将注射针移至12g/100mL聚乙烯吡咯烷酮滴中反复吸吹几遍后，再移至精子悬液滴中，20倍镜下吸取单个精子，再移至6g/100mL聚乙烯吡咯烷酮滴中确定精子在针中的位置，并弹掉针壁上沾上的多余精子，最后将注射针移至羊精子上浮液液注射滴中，10倍镜下用持卵针调整并固定卵母细胞，使第一极体处于12点钟或6点钟位置，将注射针内的精子推至针尖处，在3点钟方向进注射针，进注射针后先回吸少量的胞质后再注射精子，注射后将活的卵母细胞置于G1发育液中准备进行孤雌激活处理；S5，ICSI胚胎体外培养孤雌激活处理后的胚胎在饱和湿度的培养箱中继续培养，48h后在G1发育液滴中加入体积分数10％FBS继续培养至72h，在第3d移入G2发育液中继续培养至7-8d，得到盘羊-绵羊杂交囊胚。优选的，S4中，在ICSI注射盘上分别制作羊精子上浮液液注射滴4个、12g/100mL聚乙烯吡咯烷酮滴2个、6g/100mL聚乙烯吡咯烷酮滴4个和S2的精子悬液滴2个。优选的，所述羊精子上浮液为HEPES-SOF液，10ml的HEPES-SOF液配方如下：胚胎培养水7.8ml，100×HEPES-SOF液1ml,10×NaHCO3溶液0.2ml，100×Napyruvate溶液0.1ml，100×CaCl2·2H2O溶液0.1ml，100×Hepes溶液0.8ml；上述组分混匀后弃掉0.2ml，再加入0.2ml的FBS。pH值调至7.2-7.4；100×HEPES-SOF液配方如下：NaCl6.29g，KCl0.534g，KH2PO40.162g，MgSO4·7H2O0.182g，链霉素0.05g，青霉素0.065g，乳酸钠0.6ml，加胚胎培养水定容至100ml。10×NaHCO3溶液配方：NaHCO30.221g溶于10ml胚胎培养水中。100×Napyruvate溶液配方：丙酮酸钠0.044g溶于10ml胚胎培养水中。100×CaCl2·2H2O溶液配方：CaCl2·2H2O0.262g溶于10ml胚胎培养水中。100×Hepes溶液配方：Hepes0.651g溶于10ml胚胎培养水中。优选的，取外径1.0mm、内径0.75mm的毛细玻璃管用拉针仪制作注射针，注射针前端直径6-8μm，前端的弯曲角度为30度；取外径1.0mm、内径0.8mm的毛细玻璃管，用酒精灯拉制外径100-120μm的持卵针，持卵针前端口径20-30μm，持卵针前端的弯曲角度为30度。优选的，所述冻存液由以下体积分数的液体混合而成：70％的高糖型DMEM液体培养基、20％的胎牛血清、10％的二甲基亚砜。优选的，S2中，精子悬液在20倍显微镜下时，看到单个精子之间的距离大于等于0.3cm。优选的，S3的具体步骤如下：将离体的绵羊卵巢用37℃预热的含有青霉素和链霉素的生理盐水清洗，剪去周围粘连组织；然后置于M199采卵液内，割破卵泡，使卵丘卵母细胞复合体从卵泡中释放出来，挑出卵丘卵母细胞复合体，并置于新的M199采卵液中，将挑出的卵丘卵母细胞复合体用体外成熟液清洗，38.5℃，5％CO2的培养箱中培养22-24h，挑出含有第一极体的成熟卵母细胞置于体外成熟液中，备用。优选的，每升M199采卵液中含有9.5gM199培养基粉末、5mmolNaHCO3、10mmolHEPES、10mmolHEPES-Na、10mLFBS、0.01g肝素钠和100×青链霉素混合液，溶剂为超纯水。优选的，每升体外成熟液中含有0.4mmol丙酮酸钠、10mLFBS、10mg促卵泡素FSH、10mg促黄体素LH、20μg表皮生长因子EGF、1mg雌二醇，溶剂为M199液体培养基。与现有技术相比，本专利技术提供的利用盘羊睾丸组织精子体外生产胚胎的方法至少具有以下有益效果：1、本专利技术中所涉及的睾丸组织精子分离技术操作简单省时，不需要考虑杂细胞、精子数量和活力的因素。2、本专利技术中所涉及的ICSI注射盘的制作和ICSI操作流程，通过尽量减少注射针在各操作滴之间的移动次数和距离，从而可尽快完成卵母细胞的注射，以减少卵子在外界环境中的时间，填补了利用盘羊睾丸组织精子体外生产胚胎技术的空白。附图说明图1是ICSI注射盘的制作及注射针移动顺序；图2是ICSI胚胎体外培养20小时后形成原核并排出第二极体的合子；图2A是显微镜明场拍摄的发育至20h的ICSI胚胎；图2B显微镜紫外光激发的发育至20h的ICSI胚胎的细胞核和极体；图2A和图2B是同一个细胞；图3是ICSI胚胎体外培养8d后形成的盘羊-绵羊杂交囊胚。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术进行详细说明，但应当理解本专利技术的保护范围并不受具体实施方式的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，未注明的试验材料来源均为市售，由于不涉及专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用盘羊睾丸组织精子体外生产胚胎的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，离体盘羊睾丸组织的冷冻保存，备用将离体的盘羊睾丸组织剥去外膜后，将睾丸实质部分剪碎并置于含冻存液的冻存管中，4℃放置2‑3h后投入液氮中长期冷冻保存，备用；S2，冷冻盘羊睾丸组织中精子分离将液氮中冻存的盘羊睾丸组织取出，解冻，将解冻的睾丸组织混匀后离心，弃上清，并用羊精子上浮液清洗沉淀，最后将沉淀用羊精子上浮液液悬浮，制成精子悬液，备用；S3，绵羊卵母细胞体外培养成熟从离体的绵羊卵巢采集卵丘卵母细胞复合体，并培养至排出第一极体，得到含有第一极体的成熟卵母细胞，备用；S4，胞浆单精子注射ICSI准备ICSI注射盘：用羊精子上浮液液分别配制12g/100mL、6g/100mL的聚乙烯吡咯烷酮溶液，取容器作为ICSI注射盘，在ICSI注射盘上分别制作羊精子上浮液液注射滴、12g/100mL聚乙烯吡咯烷酮滴、6g/100mL聚乙烯吡咯烷酮滴和S2的精子悬液滴，每个液滴上覆石蜡油；ICSI操作：取熟卵母细胞置于羊精子上浮液液注射滴中，将ICSI注射盘置于37℃恒温板的显微镜下，在4倍镜下将注射针移至12g/100mL聚乙烯吡咯烷酮滴中反复吸吹几遍后，再移至精子悬液滴中，20倍镜下吸取单个精子，再移至6g/100mL聚乙烯吡咯烷酮滴中确定精子在针中的位置，并弹掉针壁上沾上的多余精子，最后将注射针移至羊精子上浮液液注射滴中，10倍镜下用持卵针调整并固定卵母细胞，使第一极体处于12点钟或6点钟位置，将注射针内的精子推至针尖处，在3点钟方向进注射针，进注射针后先回吸少量的胞质后再注射精子，注射后将活的卵母细胞置于G1发育液中准备进行孤雌激活处理；S5，ICSI胚胎体外培养孤雌激活处理后的胚胎在饱和湿度的培养箱中继续培养，48h后在G1发育液滴中加入体积分数10％FBS继续培养至72h，在第3d移入G2发育液中继续培养至7‑8d，得到盘羊‑绵羊杂交囊胚。...

【技术特征摘要】
1.一种利用盘羊睾丸组织精子体外生产胚胎的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，离体盘羊睾丸组织的冷冻保存，备用将离体的盘羊睾丸组织剥去外膜后，将睾丸实质部分剪碎并置于含冻存液的冻存管中，4℃放置2-3h后投入液氮中长期冷冻保存，备用；S2，冷冻盘羊睾丸组织中精子分离将液氮中冻存的盘羊睾丸组织取出，解冻，将解冻的睾丸组织混匀后离心，弃上清，并用羊精子上浮液清洗沉淀，最后将沉淀用羊精子上浮液液悬浮，制成精子悬液，备用；S3，绵羊卵母细胞体外培养成熟从离体的绵羊卵巢采集卵丘卵母细胞复合体，并培养至排出第一极体，得到含有第一极体的成熟卵母细胞，备用；S4，胞浆单精子注射ICSI准备ICSI注射盘：用羊精子上浮液液分别配制12g/100mL、6g/100mL的聚乙烯吡咯烷酮溶液，取容器作为ICSI注射盘，在ICSI注射盘上分别制作羊精子上浮液液注射滴、12g/100mL聚乙烯吡咯烷酮滴、6g/100mL聚乙烯吡咯烷酮滴和S2的精子悬液滴，每个液滴上覆石蜡油；ICSI操作：取熟卵母细胞置于羊精子上浮液液注射滴中，将ICSI注射盘置于37℃恒温板的显微镜下，在4倍镜下将注射针移至12g/100mL聚乙烯吡咯烷酮滴中反复吸吹几遍后，再移至精子悬液滴中，20倍镜下吸取单个精子，再移至6g/100mL聚乙烯吡咯烷酮滴中确定精子在针中的位置，并弹掉针壁上沾上的多余精子，最后将注射针移至羊精子上浮液液注射滴中，10倍镜下用持卵针调整并固定卵母细胞，使第一极体处于12点钟或6点钟位置，将注射针内的精子推至针尖处，在3点钟方向进注射针，进注射针后先回吸少量的胞质后再注射精子，注射后将活的卵母细胞置于G1发育液中准备进行孤雌激活处理；S5，ICSI胚胎体外培养孤雌激活处理后的胚胎在饱和湿度的培养箱中继续培养，48h后在G1发育液滴中加入体积分数10％FBS继续培养至72h，在第3d移入G2发育液中继续培养至7-8d，得到盘羊-绵羊杂交囊胚。2.根据权利要求1所述的利用盘羊睾丸组织精子体外生产胚胎的方法，其特征在于，S4中，在ICSI注射盘上分别制作羊精子上浮液液注射滴4个、12g/100mL聚乙烯吡咯烷酮滴2个、6g/100mL聚乙烯吡咯烷酮滴4个和S2的精子悬液滴2个。3.根据权利要求1或2所述的利用盘羊睾丸组织精子体外生产胚胎的方法，其特征在于，所述羊精子上浮液为HEPES-SOF液，10ml的HEPES-SOF液配方如下：胚胎培养水7.8ml，100×HEPES-SOF液1ml,10×NaHCO3溶液0.2ml，100×Napyruvate溶液0.1ml，100×CaCl2·2H2O溶液0.1ml，100×Hepes溶液0.8ml；上述组分混匀后弃掉0.2m...

【专利技术属性】
技术研发人员：张瑞娜，贾功雪，杨其恩，张晓娜，李永元，保万秀，茹巧红，王国庆，
申请(专利权)人：中国科学院西北高原生物研究所，
类型：发明
国别省市：青海,63