一种快速培养结核病致病菌的培养方法技术

本发明专利技术属于生物实验方法的设计技术领域，具体公开一种快速培养结核病致病菌的培养方法，包括下述步骤：（一）培养基的制备与保存；（二）样本处理；（三）结核病致病原快速培养。同时使用该培养基和培养方法可快速进行结核病致病菌培养、鉴定；获得的纯菌落可进行多种药物敏感实验，并可长期保存结核分枝杆菌复合群细菌。该培养基和培养方法培养结果容易观察，应用范围广泛。

A Rapid Culture Method for Pathogenic Bacteria of Tuberculosis

【技术实现步骤摘要】
一种快速培养结核病致病菌的培养方法
本专利技术属于生物实验方法的设计
，具体公开一种快速培养结核病致病菌的培养方法。
技术介绍
结核病是由结核分枝杆菌复合群细菌所引起的人畜共患的慢性消耗性传染病。要控制结核病的发生和流行，必须加强对该病的检测。结核分枝杆菌复合群细菌是结核病的致病菌，为抗酸的杆菌，主要通过呼吸道传播。及时、有效的诊断是控制结核病关键，其中其致病菌培养是实验室诊断的主要方法之一，但结核分枝杆菌复合群细菌属缓慢生长分枝杆菌，其自身分裂周期长、生长速度慢，且在样本处理过程中易受损伤，导致分离培养耗时长。当前，实验室的常用培养基有改良罗氏培养基(L-J培养基)和丙酮酸钠培养基，虽然这两种培养基已使用有百年的历史，但是这两种培养基培养时间长，已分离的纯培养物需25天以上，临床病料中的病原分离需要60天以上才可见到典型菌落，达不到快速诊断的目的。近年来，用于培养结核病致病菌的新型改良培养基越来越多，在国内相关实验中，添加烟酸的新型改良罗氏培养基，添加维生素E及猪肺汤的改良培养基，以及在原有培养基成分中加入土豆、鸡蛋或平菇等营养物质的培养基均有出现。以上这些培养基和培养方法尽管缩短了结核致病菌的培养时间，仍需要20天以上，且所需药品或培养基成分要求高，受设施和条件限制，不利于广泛使用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于：设计一种能快速分离结核病致病菌的培养方法，在结核病致病菌损伤修复培养基(DRM培养基)中进行预培养后，可提高细菌增殖率，并降低了在生长过程中的高营养需求，从而加速了结核病致病菌的生长，缩短了培养时间。本专利技术的技术方案：一种快速培养结核病致病菌的培养方法，该培养方法包括下述步骤：一、培养基的制备与保存(一)0.3％琼脂高糖DRM培养基的制备(1)将L-天冬酰胺1g，磷酸二氢钾1.5g，磷酸氢二钠2.5g，七水硫酸镁0.5g，二水柠檬酸纳1.3g，柠檬酸铁胺0.05g，丙酮酸钠2.4g，琼脂粉3g，水1000mL溶解后，在115-121℃，高压条件下，20min，制备成0.3％琼脂快速培养基，备用；(2)称取100g白糖，加入50mL水，在45-50℃充分溶解，110-115℃，高压10-15min灭菌后制备成200％高糖液，备用；(3)无菌条件下，在加高压除菌后处于60-80℃的143mL的200％高糖液加到同等条件下1000mL0.3％琼脂快速培养基中，充分混匀，制备成0.3％琼脂高糖DRM培养基分装，18mm×150mm试管，每管7mL，4℃保存备用；(二)Lowenstein-Jensen培养基的制备(1)将天门冬素3.6g，磷酸二氢钾2.4g，七水硫酸镁0.24g，柠檬酸镁0.6g，丙三醇12mL，蒸馏水600mL，充分溶解后备用；(2)向步骤(1)中加入可溶性淀粉30g，混匀，煮沸35-45min，成透明糊状溶液，冷却后备用；(3)向步骤(2)中加入经过滤后的新鲜鸡卵液1000mL，混匀，备用；(4)最后，向步骤(3)中加入2％孔雀绿水溶液20mL，混匀，分装，18mm×150mm试管，每管7mL，放置斜面高度占试管三分之二，在温度条件85℃，45min间歇灭菌两次，37℃无菌测定24h后，4℃贮存备用；(三)丙酮酸钠培养基的制备(1)先将天门冬素3.6g，磷酸二氢钾2.4g，七水硫酸镁0.24g，柠檬酸镁0.6g，丙酮酸钠1.6g，蒸馏水600mL，充分溶解后，用4％NaOH校正至pH7.2后，加入葡萄糖4.0g混匀备用；(2)向步骤(1)中加入可溶性淀粉30g，混匀，煮沸35-45min成透明糊状溶液，冷却后备用；(3)向步骤(2)中加入经过滤后的新鲜鸡卵液1000mL，混匀，备用；(4)最后，向步骤(3)中加入2％孔雀绿水溶液20mL，混匀，分装，18mm×150mm试管，每管7mL，放置斜面高度占试管三分之二，在温度条件85℃，45min间歇灭菌两次，37℃无菌测定24h后，4℃贮存备用；二、样本处理(一)组织样本处理(1)研磨组织：将采集到的肺脏、淋巴病变组织，用剪刀剪成小块，然后加入生理盐水，用研磨棒研磨，制成乳剂；(2)碱处理：取2mL～4mL乳剂液，加人等量的4％NaOH溶液，充分振摇5～10min；(3)酸平衡：碱处理10min后，用2mol/L的HCL调pH值至6.5-7.0，在10min之内完成；(4)离心：酸碱处理后的菌液，离心20min，4000rpm，弃上清，沉淀加入生理盐水，充分混匀；(二)鼻拭子样品的处理(1)将含鼻拭子样品的生理盐水用4000rpm离心20min，收集沉淀，加入适量的生理盐水；(2)碱处理：同步加入等量4％NaOH和2.94％枸橼酸钠溶液中，其中枸橼酸钠溶液中含1％N-乙酰-L半胱胺酸，室温静置20分钟，使粘液液化至清亮；(3)酸平衡：碱处理20min后，用2mol/L的HCL调pH值至6.5-7.0，在10min之内完成；(4)离心：酸碱处理后的菌液，离心20min，4000rpm，弃上清，沉淀加入生理盐水，充分混匀；(三)结核病致病原快速培养：酸、碱处理后的菌液，用无菌的一次性滴管取0.2mL菌液垂直穿刺至含0.3％琼脂高糖DRM培养基，置37℃恒温培养箱中预培养3天；3天后用无菌的一次性滴管取0.2mL菌液转接至丙酮酸钠培养基和/或L-J培养基斜面，置37℃恒温培养箱中培养，从第三天开始进行观察培养基中细菌的生长情况并做记录。优化设计，所述新鲜鸡卵液的制备过程为：先将新鲜鸡蛋清洗干净，晾干，再浸泡在75％酒精中10-15min；再挑拣消毒后的无裂缝鸡蛋取鸡卵。优化设计，所述的可溶性淀粉为马铃薯淀粉。本专利技术的有益效果：该DRM培养基具有使抗酸染色阳性菌培养时间较短，生长速度较快且能快速形成典型菌落等特点，检测效果好及成本低。结核杆菌培养前在DRM培养基中进行预培养能够缩短培养基时间，对结核病的科研研究和早期诊断有一定的意义。同时使用该培养基和培养方法可快速进行结核与非结核分支杆菌培养、鉴定；获得的纯菌落可进行多种药物敏感实验，并可长期保存结核与非结核分支杆菌。该培养基和培养方法培养结果容易观察，应用范围广泛。具体实施方式实施例1、快速培养结核病致病菌的培养方法一、试剂及制备样品处理溶液的制备：(1)生理盐水：氯化钠0.85g，加蒸馏水至100mL，15磅高压20min，4℃保存备用；(2)4％NaOH；(3)2.94％枸橼酸钠；(4)1％N-乙酰基-L-半胱氨酸1、0.1％琼脂DRM培养基：(1)培养基组成：L-天冬酰胺1g，磷酸二氢钾1.5g，磷酸氢二钠2.5g，七水硫酸镁0.5g，二水柠檬酸纳1.3g，柠檬酸铁胺0.05g，丙酮酸钠2.4g，琼脂粉1g，水1000mL；(2)制备和保存：上述成分溶解后充分混匀，115-121℃，高压20min，分装，18mm×150mm试管，每管7mL，置4℃保存备用。2、0.3％琼脂高糖DRM培养基(1)培养基组分：L-天冬酰胺1g，磷酸二氢钾1.5g，磷酸氢二钠2.5g，七水硫酸镁0.5g，二水柠檬酸纳1.3g，柠檬酸铁胺0.05g，丙酮酸钠2.4g，琼脂粉3g，水1000mL。上述成分溶解后充分混匀，115-121℃，高压20min备用。(2)200％高糖的制备：称取1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速培养结核病致病菌的培养方法，其特征在于：该培养方法包括下述步骤：一、培养基的制备与保存 （一）0.3%琼脂高糖DRM培养基的制备（1）将L‑天冬酰胺 1g，磷酸二氢钾 1.5g，磷酸氢二钠 2.5g，七水硫酸镁 0.5g，二水柠檬酸纳 1.3g，柠檬酸铁胺 0.05g，丙酮酸钠 2.4g，琼脂粉 3g，水 1000mL溶解后，在115‑121℃，高压条件下，20min，制备成0.3%琼脂快速培养基，备用；（2）称取100g白糖，加入50mL水，在45‑50℃充分溶解，110‑115℃，高压10‑15 min灭菌后制备成200%高糖液，备用；（3）无菌条件下，在加高压除菌后处于60‑80℃的143mL的200%高糖液加到同等条件下1000mL 0.3%琼脂快速培养基中，充分混匀，制备成0.3%琼脂高糖DRM培养基分装，18mm×150mm试管，每管7mL， 4℃保存备用；（二）Lowenstein‑Jensen培养基的制备（1）将天门冬素 3.6g，磷酸二氢钾 2.4g，七水硫酸镁 0.24g，柠檬酸镁0.6g，丙三醇 12mL，蒸馏水600mL，充分溶解后备用；（2）向步骤（1）中加入可溶性淀粉30g，混匀，煮沸35‑45min，成透明糊状溶液，冷却后备用；（3）向步骤（2）中加入经过滤后的新鲜鸡卵液1000mL，混匀，备用；（4）最后，向步骤（3）中加入2%孔雀绿水溶液20mL，混匀，分装，18mm×150mm试管，每管7mL，放置斜面高度占试管三分之二，在温度条件85℃，45min间歇灭菌两次，37℃无菌测定24h后，4℃贮存备用；（三）丙酮酸钠培养基的制备（1）先将天门冬素 3.6g，磷酸二氢钾 2.4g，七水硫酸镁 0.24g，柠檬酸镁 0.6g，丙酮酸钠 1.6g，蒸馏水 600mL，充分溶解后，用4%NaOH校正至pH7.2后，加入葡萄糖4.0g混匀备用；（2）向步骤（1）中加入可溶性淀粉30g，混匀，煮沸35‑45min成透明糊状溶液，冷却后备用；（3）向步骤（2）中加入经过滤后的新鲜鸡卵液1000mL，混匀，备用；（4）最后，向步骤（3）中加入2%孔雀绿水溶液20mL，混匀，分装，18mm×150mm试管，每管7mL，放置斜面高度占试管三分之二，在温度条件85℃，45min间歇灭菌两次，37℃无菌测定24h后，4℃贮存备用；二、样本处理（一）组织样本处理（1）研磨组织：将采集到的肺脏、淋巴病变组织，用剪刀剪成小块，然后加入生理盐水，用研磨棒研磨，制成乳剂；（2）碱处理：取2mL～4mL乳剂液，加人等量的4%NaOH溶液，充分振摇5～10min；（3）酸平衡：碱处理10min后，用2mol/L的HCL调pH值至6.5‑7.0，在10min之内完成；（4）离心：酸碱处理后的菌液，离心20min，4000rpm，弃上清，沉淀加入生理盐水，充分混匀；（二）鼻拭子样品的处理（1）将含鼻拭子样品的生理盐水用4000 rpm离心20 min，收集沉淀，加入适量的生理盐水；（2）碱处理：同步加入等量4% NaOH和2.94%枸橼酸钠溶液中，其中枸橼酸钠溶液中含1%N‑乙酰‑L半胱胺酸，室温静置20分钟，使粘液液化至清亮；（3）酸平衡：碱处理20min后，用2mol/L的HCL调pH值至6.5‑7.0，在10min之内完成；（4）离心：酸碱处理后的菌液，离心20min，4000rpm，弃上清，沉淀加入生理盐水，充分混匀；（三）结核病致病原快速培养：酸、碱处理后的菌液，用无菌的一次性滴管取0.2mL菌液垂直穿刺至含0.3%琼脂高糖DRM培养基，置37℃恒温培养箱中预培养3天；3天后用无菌的一次性滴管取0.2mL菌液转接至丙酮酸钠培养基和/或L‑J培养基斜面，置37℃恒温培养箱中培养，从第三天开始进行观察培养基中细菌的生长情况并做记录。...

【技术特征摘要】
1.一种快速培养结核病致病菌的培养方法，其特征在于：该培养方法包括下述步骤：一、培养基的制备与保存（一）0.3%琼脂高糖DRM培养基的制备（1）将L-天冬酰胺1g，磷酸二氢钾1.5g，磷酸氢二钠2.5g，七水硫酸镁0.5g，二水柠檬酸纳1.3g，柠檬酸铁胺0.05g，丙酮酸钠2.4g，琼脂粉3g，水1000mL溶解后，在115-121℃，高压条件下，20min，制备成0.3%琼脂快速培养基，备用；（2）称取100g白糖，加入50mL水，在45-50℃充分溶解，110-115℃，高压10-15min灭菌后制备成200%高糖液，备用；（3）无菌条件下，在加高压除菌后处于60-80℃的143mL的200%高糖液加到同等条件下1000mL0.3%琼脂快速培养基中，充分混匀，制备成0.3%琼脂高糖DRM培养基分装，18mm×150mm试管，每管7mL，4℃保存备用；（二）Lowenstein-Jensen培养基的制备（1）将天门冬素3.6g，磷酸二氢钾2.4g，七水硫酸镁0.24g，柠檬酸镁0.6g，丙三醇12mL，蒸馏水600mL，充分溶解后备用；（2）向步骤（1）中加入可溶性淀粉30g，混匀，煮沸35-45min，成透明糊状溶液，冷却后备用；（3）向步骤（2）中加入经过滤后的新鲜鸡卵液1000mL，混匀，备用；（4）最后，向步骤（3）中加入2%孔雀绿水溶液20mL，混匀，分装，18mm×150mm试管，每管7mL，放置斜面高度占试管三分之二，在温度条件85℃，45min间歇灭菌两次，37℃无菌测定24h后，4℃贮存备用；（三）丙酮酸钠培养基的制备（1）先将天门冬素3.6g，磷酸二氢钾2.4g，七水硫酸镁0.24g，柠檬酸镁0.6g，丙酮酸钠1.6g，蒸馏水600mL，充分溶解后，用4%NaOH校正至pH7.2后，加入葡萄糖4.0g混匀备用；（2）向步骤（1）中加入可溶性淀粉30g，混匀，煮沸35-45min成透明糊状溶液，冷却后备用；（3）向步骤（2）中加入经过滤后的新鲜鸡卵液1000mL，混匀，备用...

【专利技术属性】
技术研发人员：古努尔·吐尔逊，王登峰，米晓云，努尔拜合提·努尔旦，郭慧玲，呼西丹·阿巴拜克力，沙依兰·卡伊扎，吴建勇，洪都孜·波拉提，李建军，巴特力·贾尼木汗，海拉提·阿里特恩别克·吐尔干拜耶夫，阿依娜曦·霍贾赫米提·贾依木别特瓦，古丽贾伊娜尔·塔力哈提·萨尔森沃夫瓦，阿斯亚·马叶恩沃夫瓦娜·波尔沈巴伊娃，
申请(专利权)人：新疆畜牧科学院兽医研究所新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心，
类型：发明
国别省市：新疆,65