一种卤醇脱卤酶文库定量筛选方法及相关微流体系统技术方案

一种卤醇脱卤酶文库定量筛选方法及相关微流体系统，属于酶工程技术领域。本发明专利技术利用卤醇脱卤酶催化底物释放质子造成pH降低，pH降低可通过指示剂颜色改变来反映，在比色原理的基础上搭建集成图像采集和图像分析设备的微流体系统。所述文库定量筛选的方法基于纸质微流体平台，在固定有指示剂的微流体载体上吸附卤醇脱卤酶，滴加底物后进行孵育，通过指示剂检测pH值变化，发生颜色变化后进行图像采集，通过图像分析获取质子浓度和指示剂颜色强度的线性关系作为标准曲线，基于所述标准曲线检测吸附卤醇脱卤酶突变体的微流体反应体系中质子浓度，通过微流体反应体系中质子浓度实现酶活性的测定。本发明专利技术具有简单、快速、灵敏的特点，实现了卤醇脱卤酶文库的定量筛选。

A Quantitative Screening Method for Halogen Dehalogenase Library and Related Microfluidic Systems

【技术实现步骤摘要】
一种卤醇脱卤酶文库定量筛选方法及相关微流体系统
本专利技术属于酶工程
，具体涉及一种卤醇脱卤酶文库定量筛选方法及相关微流体系统。
技术介绍
卤醇脱卤酶(HHDHs)是生物
重要的酶，它能催化卤代醇发生脱卤反应，生成环氧化物，质子和卤离子。来自A.radiobacterAD1的卤醇脱卤酶HheC与来自RhodococcusrhodochrousNCIMB13064的卤代烷烃脱卤酶DhaA可以共同应用于1,2,3-TCP的生物降解过程中，是降解有机卤化物的有效手段。此外，HHDHs具有良好的立体和区域选择性，可用于生产有价值的手性β-取代醇，在化合物合成领域中备受关注。到目前为止，卤醇脱卤酶已成功应用于手性环氧化物，卤代醇，氰醇，叠氮醇的合成。其中，前体化合物(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯在HHDHs的催化作用下，以(S)-环氧化物作为中间体，广泛地应用在他汀类药物(R)-4-氰基-3-羟基丁酸酯的生产过程中。尽管HHDHs具有如此优越的催化潜力，但是天然酶在催化活性、稳定性和选择性等方面往往难以满足工业化生产的需要。为了能够快速实现HHDHs催化过程的产业化应用，对其进行分子改造是必不可少的。目前，酶的改造主要通过以下两条途径来实现。一是通过计算机的分析计算，结合基因工程对酶的DNA序列进行改造，如定点突变等；二是利用基因工程技术模拟自然界中的进化，如定向突变等。前者是以已知一些信息如酶的功能位点、空间结构等为依据对酶分子进行改造，虽然目标明确但对于改造已知信息有限的酶存在很大局限性；后者的实用性相对更强，具有普适性。定向进化技术不需要事先了解酶的空间结构与催化机制，构建随机突变文库，通过高通量筛选方法得到某些特性改良的突变酶体。定向突变体文库的建立包括对亲本酶基因进行突变，创造多样性基因，再导入适当的载体中进行文库的构建。建立突变文库的方法比较通用，也能满足库容较大文库的需求，而文库筛选方法的筛选能力是制约定向进化技术的最大瓶颈。由于突变基因文库往往被亚克隆并在微生物中表达，因此对大量微生物细胞的筛选首先要进行有效分离，然后用酶检测技术或其他信号检测技术(比如分光光度、气相色谱、高效液相色谱、质谱、核磁共振等)进行检测，筛选的有效性很大程度上取决于酶检测技术的水平和各种信号探测技术的应用。因此合适的筛选方法是能否获得优良的卤醇脱卤酶突变体的关键。传统文库筛选方法主要有平板克隆筛选、噬菌体展示技术、96孔板筛选、荧光激活细胞分选(FACS)技术。但是这些方法在不同程度上依然不能满足目前文库筛选的需要。平板克隆筛选的操作比较简单，但灵敏度差，不易反映微小变化，无法实现定量检测并且筛选的工作量非常大，而且还受到很多酶不具备相应筛选底物的限制。噬菌体展示技术是一种高通量的筛选技术，可高选择性地筛选复杂分子，但是需要进行细胞克隆操作，并且这种技术并不是一种定量筛选，只能筛选出具有酶活的克隆，而对活性的强弱不能进行很好地分辨。96孔板筛选的优势在于减小测定体积，反应周期短，但其本身同样无法实现定量检测。平板克隆筛选、噬菌体展示技术和96孔板筛选由于只是定性的筛选，不能准确的反映突变体的真正催化活性，在经过文库筛选后，还要进一步鉴定酶活力，才可以确定突变体的酶活力的改变程度，比如96孔板筛选结合分光光度计进行文库筛选和定量判定，以区分高酶活和低酶活的突变体，但这种方法要想实现高通量、快速筛选则需要配套多通道、多波长检测仪器，设备投入较大、技术操作复杂；此外，还可通过HHDHs脱卤作用产生的质子和卤离子对其活性进行测定，但是这种方法通常需要重金属汞离子，产生的废液对环境造成极大污染。关于定量文库筛选目前主要是FACS技术，虽然这一项技术能对大容量样本进行超高通量的定量分析和筛选，具有显著优势，但仍然存在仪器成本高、应用范围窄，难以应用于大规模的工业化生产的局限性。在微观尺寸下控制、操作和检测复杂流体的微流体技术作为一种新兴的系统化平台技术，在近年来备受瞩目，并在生物技术，医学，化学和材料科学领域具有广泛应用。其中，基于纸质微流体平台广泛应用在诊断、食品安全和环境监测分析平台，具有简单，低成本，可携带，可生物降解等优势。因此，基于该技术本专利技术考虑设计一种快速、定量筛选卤醇脱卤酶文库的方法。
技术实现思路
针对现有文库筛选方法存在的问题，本专利技术提供了一种基于纸质微流体平台通过图像分析pH变化所引起颜色变化实现快速、定量筛选卤醇脱卤酶的方法和相关微流体系统。一种用于酶蛋白文库筛选的微流体系统，其特征在于，包括微流体平台、图像采集设备以及后端图像分析设备；所述微流体平台包括吸附有pH指示剂和缓冲液的载体，所述微流体平台用于反映文库中酶蛋白突变体催化底物导致微环境pH变化所引起的颜色变化，所述图像采集设备用于采集微流体平台的颜色图片，所述图像分析设备用于分析所述颜色图片的颜色强度并基于质子浓度与pH指示剂颜色强度之间的标准曲线计算酶活。进一步地，所述标准曲线为0～1.2mM范围内质子浓度与pH指示剂最终颜色强度之间的线性关系。进一步地，所述载体具体优选为玻璃纤维或纤维素纸。进一步地，所述载体采用打孔机制成直径为6～8mm的圆形纸盘。进一步地，所述pH指示剂为苯酚红指示剂，所述缓冲液为HEPES缓冲液。一种卤醇脱卤酶文库筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤A：构建微流体平台；在载体上吸附苯酚红指示剂和HEPES缓冲液；步骤B：建立标准曲线；在0～1.2mM范围内选择多个已知浓度的HCl溶液，将已知浓度的HCl溶液滴加到吸附有HEPES缓冲液的载体上，然后滴加苯酚红溶液进行反应，在苯酚红指示剂作用下载体颜色发生改变，待反应完成后采集载体颜色，不同浓度的HCl溶液重复上述步骤，得到不同浓度HCl溶液下载体的颜色图片；通过对不同浓度HCl溶液下pH指示剂的颜色强度进行分析，建立得到pH指示剂颜色强度与质子浓度的线性关系作为标准曲线；步骤C：文库定量筛选；将文库中卤醇脱卤酶突变体吸附在经步骤A处理得到的载体上，然后加入卤醇脱卤酶的底物进行孵育，待孵育完成，在苯酚红指示剂作用下载体颜色发生改变，待反应完成后采集载体颜色，分析图像中颜色强度并根据步骤B得到标准曲线得到质子浓度，再通过质子浓度测定酶的活性。进一步地，所述步骤A中载体具体优选为玻璃纤维或纤维素纸。进一步地，所述步骤A中载体采用打孔机制成直径为6～8mm的圆形纸盘。进一步地，所述步骤A中HEPES缓冲液的浓度范围优选为0.5～2mM。进一步地，所述步骤C中卤醇脱卤酶突变体为无细胞酶提取物或者全细胞酶提取物。进一步地，所述全细胞酶提取物的制作流程如下：将卤醇脱卤酶的基因组转入大肠杆菌中，在培养基中培养，加入诱导剂进行温育，诱导完成后收集细胞，悬浮于缓冲液4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)中，得到用于文库筛选的全细胞酶提取物。进一步地，所述无细胞酶提取物的制作流程如下：将卤醇脱卤酶的基因组转入大肠杆菌中，在培养基中培养，加入诱导剂，于37℃温育18小时，诱导完成后收集细胞，悬浮于缓冲液4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)中进行超声裂解，离心细胞裂解物，得到上清液作为用于文库筛选的无细胞酶提取物。具体地，所述无细胞酶提取物或者全细胞酶提本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于酶蛋白文库筛选的微流体系统，其特征在于，包括微流体平台、图像采集设备以及后端图像分析设备；所述微流体平台包括吸附有pH指示剂和缓冲液的载体，所述微流体平台用于反映文库中酶蛋白突变体催化底物导致微环境pH变化所引起的颜色变化，所述图像采集设备用于采集微流体平台的颜色图片，所述图像分析设备用于分析所述颜色图片的颜色强度并基于质子浓度与颜色强度间的标准曲线计算酶活。

【技术特征摘要】
1.一种用于酶蛋白文库筛选的微流体系统，其特征在于，包括微流体平台、图像采集设备以及后端图像分析设备；所述微流体平台包括吸附有pH指示剂和缓冲液的载体，所述微流体平台用于反映文库中酶蛋白突变体催化底物导致微环境pH变化所引起的颜色变化，所述图像采集设备用于采集微流体平台的颜色图片，所述图像分析设备用于分析所述颜色图片的颜色强度并基于质子浓度与颜色强度间的标准曲线计算酶活。2.根据权利要求1所述的一种用于酶蛋白文库筛选的微流体系统，其特征在于，所述酶蛋白突变体为卤醇脱卤酶突变体，所述pH指示剂为苯酚红指示剂，所述缓冲液为HEPES缓冲液。3.根据权利要求2所述的一种用于酶蛋白文库筛选的微流体系统，其特征在于，所述标准曲线为0～1.2mM范围内质子浓度与pH指示剂最终颜色强度之间的线性关系。4.根据权利要求1所述的一种用于酶蛋白文库筛选的微流体系统，其特征在于，所述载体具体为玻璃纤维或纤维素纸。5.一种卤醇脱卤酶文库定量筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤A：构建微流体平台；在载体上吸附苯酚红指示剂和HEPES缓冲液；步骤B：建立标准曲线；在0～1.2mM范围内选择多个已知浓度的HCl溶液，将已知浓度的HCl溶液滴加到吸附有HEPES缓冲液的载体上，然后滴加苯酚红溶液进行反应，在苯酚红指示剂作用下载体颜色发生改变，待反应完成后采集载体颜色，不同浓度的HCl溶液重复上述步骤，得到不同浓度HCl溶液下载体的颜色图片；通过对不同浓度HCl溶液下载体的颜色强度进行分析，建立得到颜色强度与质子浓度的线性关系作为标准曲线；步骤C：文库定量筛选；将文库中卤醇脱卤酶突变体吸附在经步骤A处理得到的载体上，然后加入卤醇脱卤酶的底物进行孵育，待孵育完成，在苯酚红指示...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤丽霞，伊嘉格尔，陈勇，邓娇，方瑞琴，
申请(专利权)人：电子科技大学，
类型：发明
国别省市：四川,51