一种用于肺癌诊断及转移预警的试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种基于血小板LncRNA‑GTF2H2的早期肺癌诊断的试剂盒研发，属于医疗卫生领域。所述标志物选自血浆血小板LncRNA‑GTF2H2；所述的的试剂盒，包括：逆转录反应体系、荧光定量PCR反应体系和内参体系。相比于健康供者，肺癌患者血浆血小板中LncRNA‑GTF2H2表达水平显著降低，ROC曲线分析显示，AUC为0.723，灵敏度为86.7％，特异性为51.9％。相比于健康供着，在早期肺癌患者中LncRNA‑GTF2H2表达显著降低。ROC曲线分析显示，AUC为0.629，灵敏度80.6％，特异性为51.9％。相比于非淋巴结转移性肺癌患，淋巴结转移性肺癌患者中LncRNA‑GTF2H2表达降低。

A Kit for Diagnosis and Metastasis Warning of Lung Cancer

【技术实现步骤摘要】
一种用于肺癌诊断及转移预警的试剂盒
本专利技术涉及一种基于血小板LncRNA-GTF2H2的早期肺癌诊断的试剂盒研发，属于医疗卫生领域。
技术介绍
肺癌是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一。尽管目前手术、放疗、化疗及靶向治疗等治疗手段不断改善，肺癌患者的死亡率依然居高不下，主要是因为肺癌起病隐蔽，缺乏特异性早期临床表现，大部分患者在诊断时已是局部晚期或远处转移，失去治愈的机会。因此，临床上亟需敏感性和特异性理想的生物标志物，用于肺癌早期诊断及协助临床决策。血小板是直径2-4μm的无核血细胞，来源于骨髓中的巨核细胞，半衰期短仅7-10天，在人体血液循环中数量仅次于红细胞排第二。除了止血的作用外，血小板也在肿瘤进展中发挥重要作用。首先，血小板能够产生血管生成素-1等，促进血管内皮细胞增殖和新生血管的产生，从而为肿瘤细胞植入和生长提供合适的微环境；同时，肿瘤细胞还能活化循环中静息血小板，后者能减少局部肿瘤细胞凋亡，并且通过直接的物理作用和释放TGF-β诱导肿瘤细胞中的上皮—间充质转换（EMT）。其次，活化血小板成为肿瘤细胞与血管内皮细胞粘附的桥梁，介导肿瘤细胞粘附到并穿越血管壁进入血液循环。在血液中，循环肿瘤细胞（CTC）引起血小板聚集，形成血小板—肿瘤细胞复合物，不仅能帮助肿瘤细胞遮挡由血流剪接力引起的机械损伤，还可以保护肿瘤细胞逃脱免疫系统的攻击，因此血小板参与了肿瘤发生发展全过程。循环血小板在其整个生命周期内一方面与肿瘤细胞相互作用，获取肿瘤相关的生物分子；另一方面还可以不断摄取并富集循环中游离的蛋白质、核酸以及囊泡、颗粒等。经此，血小板如同被教育一般，其蛋白质组和RNA表达谱发生显著变化，因此被称为“肿瘤教育血小板（tumoreducatedplatelet，TEP）”；同时得益于其封闭的膜结构，血小板能够隔离循环中的生物活性分子，其获得肿瘤相关的生物学信息得以完整的保存，成为肿瘤来源的生物活性分子的大量且浓缩生物储存库。基于以上这些原因，血小板携带的物质具有极大的潜力成为新型肿瘤生物标志物。新生血小板中RNA继承自巨核细胞，巨核细胞RNA分子选择性的分配到前体血小板；而循环中血小板活化成熟，其RNA也因与周围环境分子相互作用而发生变化。目前血小板中已鉴定出多个RNA家族，包括前体和剪接成熟的mRNAs（pre-mRNA，mRNA）、microRNA、小核RNA（snRNA）、核仁小RNA（snoRNA）以及长链非编码RNA（longnon-codingRNA，LncRNA）。我们研究证实血小板LncRNA-GTF2H2在肺癌患者中表达水平明显下调，具有较好的诊断肺癌特别是早期肺癌的效能，基于此研究本专利技术提供了一种使用方便、快捷、特异性高的用于早期诊断肺癌的试剂盒。
技术实现思路
针对上述问题及现状，本专利技术提供了一种使用方便、快捷、特异性高的用于早期诊断肺癌的试剂盒。一种用于诊断早期肺癌的标志物，所述标志物选自血浆血小板LncRNA-GTF2H2；一种用于预测肺癌淋巴结转移的标志物，所述标志物选自血浆血小板LncRNA-GTF2H2；所述的血浆血小板LncRNA-GTF2H2的序列如SEQNo.1所示。一种预测肺癌淋巴结转移的试剂盒，包括：逆转录反应体系、荧光定量PCR反应体系和内参体系。所述荧光定量PCR反应体系包括针对GTF2H2的正向引物和反向通用引物；所述的针对GTF2H2的正向引物的序列如SEQNo.2所示；所述的针对GTF2H2的反向通用引物的序列如SEQNo.3所示。所述内参体系中包括内参ACTB的正向和反向引物；所述的内参ACTB的正向引物的序列如SEQNo.4所示；所述的内参ACTB的反向引物为的序列如SEQNo.5所示。所述反转录反应体系的试剂包括多聚腺苷酸聚合酶、反转录酶混合液、反转录缓冲液和无核酸酶双蒸水。上述试剂盒的制备方法，包括以下步骤：（1）提取血小板RNA；（2）提取总RNA；（3）基因组DNA去除反应反应体系：2μL5×gDNAEraserBuffer、1μLgDNAEraser、7μLTotalRNA。反应条件：42℃2分钟，或者室温5分钟-30分钟，4℃保持；（4）逆转录反应反应体系：10μL步骤1的反应液、1μLPrimeScriptRTEnzymeMixI、1μLRTPrimerMix、4μL5×PrimeScriptBuffer2（forRealTime）、4μLRNaseFreedH2O；反应条件：37℃15分钟，85℃5秒，4℃保持；（5）荧光定量PCR扩增前准备配制引物溶液：开盖前先4000rpm离心30秒-60秒；然后缓慢打开管盖子，加入适量的超纯过滤水进行溶解，使其终浓度为10μM；盖上盖子后充分震荡混匀；（6）荧光定量PCR扩增反应扩增体系：12.5μLSYBRGreenMasterMix荧光染料、0.5μL正向引物、0.5μL反向引物、1μLcDNA溶液、10.5μL无核酶水；反应条件：95℃预变性10分钟，95℃变性15秒、60℃复性1分钟、共40个循环，97℃1分钟、65℃2分钟、97℃持续检测溶解曲线；（7）内参体系反应以ACTB基因作为内参基因；具体反应体系如下：2.5μLSYBRGreenMasterMix荧光染料、0.5μL正向引物、0.5μL反向引物、1μLcDNA溶液、10.5μL无核酶水；反应条件：95℃预变性10分钟，95℃变性15秒、60℃复性1分钟、共40个循环，97℃1分钟、65℃2分钟、97℃持续检测溶解曲线；（8）数据分析绘制荧光扩增曲线和溶解曲线，得出Ct值，应用ΔCt法分析荧光定量PCR结果，ΔCt值表示目的RNA的相对表达量，ΔCt值越小表明目的RNA表达越强；ΔCt=目的RNACt值－内参RNACt值。上述试剂盒在肺癌早期诊断上的应用。本专利技术有益效果1、肺癌患者血浆血小板中LncRNA-GTF2H2表达水平显著降低本专利技术首次提出相比于健康供者，肺癌患者血浆血小板中LncRNA-GTF2H2表达水平显著降低，ROC曲线分析显示，AUC为0.723，灵敏度为86.7％，特异性为51.9％。2、早期肺癌患者中血浆血小板中LncRNA-GTF2H2表达显著降低相比于健康供着，在早期肺癌患者中LncRNA-GTF2H2表达显著降低。ROC曲线分析显示，AUC为0.629，灵敏度80.6％，特异性为51.9％。3、LncRNA-GTF2H2在淋巴结转移性肺癌患者中的表达水平低于非淋巴结转移性肺癌患者。相比于非淋巴结转移性肺癌患，淋巴结转移性肺癌患者中LncRNA-GTF2H2表达降低。附图说明图1肺癌患者血浆血小板血浆中血小板LncRNA-GTF2H2的表达水平图；图2LncRNA-GTF2H2在早期肺癌中的表达水平图；图3LncRNA-GTF2H2诊断肺癌患者的ROC曲线；图4LncRNA-GTF2H2诊断早期肺癌患者的ROC曲线；图5血浆中血小板LncRNA-GTF2H2在肺癌淋巴结转移中的表达水平图。具体实施方式以下实施用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施案例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。实施案例：LncRNA-GTF2H2诊断早期肺癌中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于诊断早期肺癌的标志物，其特征在于，所述标志物选自血浆血小板LncRNA‑GTF2H2；所述的血浆血小板LncRNA‑GTF2H2的序列如SEQ No.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于诊断早期肺癌的标志物，其特征在于，所述标志物选自血浆血小板LncRNA-GTF2H2；所述的血浆血小板LncRNA-GTF2H2的序列如SEQNo.1所示。2.一种用于预测肺癌淋巴结转移的标志物，其特征在于，所述标志物选自血浆血小板LncRNA-GTF2H2；所述的血浆血小板LncRNA-GTF2H2的序列如SEQNo.1所示。3.一种采用权利要求2所述的标志物预测肺癌淋巴结转移的试剂盒，其特征在于，包括：逆转录反应体系、荧光定量PCR反应体系和内参体系。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR反应体系包括针对GTF2H2的正向引物和反向通用引物；所述的针对GTF2H2的正向引物的序列如SEQNo.2所示；所述的针对GTF2H2的反向通用引物的序列如SEQNo.3所示。5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述内参体系中包括内参ACTB的正向和反向引物；所述的内参ACTB的正向引物的序列如SEQNo.4所示；所述的内参ACTB的反向引物的序列如SEQNo.5所示。6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述反转录反应体系的试剂包括多聚腺苷酸聚合酶、反转录酶混合液、反转录缓冲液和无核酸酶双蒸水。7.一种权利要求3所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）提取血小板RNA；（2）提取总RNA；（3）基因组DNA去除反应反应体系：2μL5×gDNAEraserBuffer、1μLgDNAEraser、7μLTotalRNA；反应条件：42℃2分钟，或者室温5分钟-30分钟，4℃保持；（4）逆转...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋现让，宋兴国，谢丽，
申请(专利权)人：宋现让，
类型：发明
国别省市：山东,37