一种I群4型禽腺病毒全悬浮的培养方法技术

本发明专利技术涉及一种I群4型禽腺病毒全悬浮的培养方法，属于病毒疫苗技术领域。上述方法包括：步骤1：制苗用细胞的传代与接种；步骤2：制苗用种毒的制备；步骤3：禽腺病毒在生物反应器中的全悬浮培养；步骤4：病毒的收获与效价检测。本申请用生物反应器全悬浮细胞培养技术代替贴壁细胞培养技术制造禽腺病毒灭活疫苗，能实现对禽腺病毒的高效培养，病毒含量比贴壁培养细胞培养高100倍以上，提高半成品质量，进而提升疫苗质量，提高疫苗的安全性和效力。

A method for full suspension culture of avian adenovirus group I type 4

【技术实现步骤摘要】
一种I群4型禽腺病毒全悬浮的培养方法
本专利技术涉及病毒疫苗
，具体是提供一种I群4型禽腺病毒全悬浮的培养方法。
技术介绍
禽I群腺病毒是家禽常见的感染病原体，呈世界性分布，目前发现所有年龄的家禽均易感，只是鉴于家禽的品种、年龄所形成的致病力不同。目前发现禽I群腺病毒对鸡具有强致病性，主要病变表现为包涵体肝炎及心包积液-肝炎综合征，该病可直接引发养鸡场20～40天龄鸡只出现30％以上的死亡率，此外其临床上也常常与传染性支气管炎病毒，呼肠孤病毒，H9亚型禽流感病毒等并发感染，导致种蛋鸡出现明显呼吸道病，关节炎，及严重的产蛋下降及畸形蛋等问题。因此目前该病已经成为严重影响养鸡场生产性能的重大疫病之一。禽腺病毒是一种双股DNA无囊膜病毒，直径69～76nm之间，二十面立体对称，有252个壳粒。鸡胚是鸡腺病毒的最佳分离培养物。但目前，禽腺病毒主要都采用贴壁鸡肝细胞培养方法实现，该传统工艺生产半成品抗原效价低，不仅影响免疫效果而且直接影响疫苗成本及价格。也有报道利用纸片载体作为细胞生长的介质进行病毒的培养，但纸片载体的价格较高，难以控制成本，工业化生产需要操作简单、成本低、生产效率高、病毒含量高的一种培养方法。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的技术问题，本专利技术提供一种I群4型禽腺病毒全悬浮的培养方法，该方法可以大量降低生产成本，而且生产周期短、病毒含量高，可显著提高疫苗产量和质量。为解决上述技术问题，本专利技术提供技术方案如下：本专利技术提供一种I群4型禽腺病毒全悬浮的培养方法，包括：步骤1：制苗用细胞的传代与接种将驯化的全悬浮LMH-s细胞复苏、传代培养后取样计数，用含10％FBS的DMEM生长液将LMH-s细胞调整为0.5×106个cells/ml，再接种到生物反应器上进行培养；步骤2：制苗用种毒的制备将在生物反应器中培养的LMH-s细胞接种禽腺病毒，然后加入维持液，接毒后继续培养；接毒后细胞培养一段时间后补加TPCK-胰酶；在细胞培养48h时取病毒液测定TCID50，之后每隔12h取样检测一次，至接毒后96h，将收获的病毒液进行无菌检验和效力检验，作为生产用种毒；步骤3：禽腺病毒在生物反应器中的全悬浮培养取生长良好的LMH-s细胞计数后接种到生物反应器中，进行生物反应器全悬浮培养；细胞培养后72h后，按体积比1-2％接种步骤2的毒种打入总体积50％的维持液，按步骤2继续培养；步骤4：病毒的收获与效价检测维持液培养后约72h后停止搅拌，此时将培养液全部收获，冻融一次后保存。进一步的，所述步骤1中，生物反应器容积为2L-200L，生物反应器在使用前需要进行电极校正、灭菌、平衡，具体方法如下；(1)生物反应器的准备：根据培养的体积选择合适的生物反应器，连接好各种管道和补料，换液的接口，接上T，pH，DO电极，对电极进行校正；(2)气密性检查：反应器中装入适量的PBS，通关闭出气口，向罐内补气，停止补气后看压力维持情况，检查罐体和连接瓶的气密性；(3)灭菌：灭菌前认真检查各管道和接头确保连接完好后进行气密性测试，测试合格后方可准备进行灭菌；根据生物反应器的规模，5L及5L以下一般采用离线灭菌，在高压锅中121℃高压30min，灭菌结束后取出自然冷却；50L及50L以上的生物反应器通常采用在位灭菌的方式灭菌。进一步的，所述生物反应器的培养条件为：温度为37.0℃，pH值为7.20，DO为40％，转速为80rpm。进一步的，所述步骤2中，LMH-s细胞生长液与接种禽腺病毒的体积比为1-1.5％；LMH-s细胞生长液与维持液的体积比为50-60％。进一步的，所述维持液为含血清1％的DMEM溶液，pH为7.20。进一步的，所述步骤2中，接毒后在细胞培养33h时补加5mg/L的TPCK-胰酶；在细胞培养约48h时取病毒液测定TCID50，之后每隔12h取样检测一次。进一步的，所述TPCK-胰酶为浓度为1.25mg/L的胰酶细胞生长液，细胞生长液为体积比例为90％的DMEM和体积比例为10％的FBS的混合液。进一步的，所述步骤3中，起始细胞密度调整为0.5×106个cells/ml，生物反应器设定如下参数温度37℃、pH7.2、搅拌速度80rpm、溶氧含量40％进行反应器自动控制培养。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：(1)用生物反应器全悬浮细胞培养技术代替贴壁细胞培养技术制造禽腺病毒灭活疫苗，能实现对禽腺病毒的高效培养，病毒含量比贴壁培养细胞培养高100倍以上。提高半成品质量，进而提升疫苗质量，提高疫苗的安全性和效力；(2)本专利技术可以大量降低生产成本，生产周期短，每个生产周期仅需9-15天，相比现有贴壁细胞培养法的21-30天以上明显缩短；(3)应用生物反应器进行疫苗生产，具有自动化程度高，生产工艺简单稳定，质量稳定，减少人工成本。附图说明图1为本专利技术I群4型禽腺病毒全悬浮的培养方法流程图。具体实施方式为使本专利技术要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。实施例1一种I群4型禽腺病毒全悬浮的培养方法，包括：步骤1：制苗用细胞的传代与接种首先选用生物反应器容积为50L，生物反应器在使用前需要进行电极校正、灭菌、平衡，具体方法如下；(1)生物反应器的准备：根据培养的体积选择合适的生物反应器，连接好各种管道和补料，换液的接口，接上温度，pH，DO电极，对电极进行校正；(2)气密性检查：反应器中装入适量的PBS，通关闭出气口，向罐内补气，停止补气后看压力维持情况，检查罐体和连接瓶的气密性；(3)灭菌：灭菌前认真检查各管道和接头确保连接完好后进行气密性测试，测试合格后方可准备进行灭菌；然后，将驯化的全悬浮LMH-s细胞复苏、传代培养后取样计数，用含10％FBS的DMEM生长液将LMH-s细胞调整为0.5×106个cells/ml，再接种到生物反应器上进行培养；温度为37.0℃，pH值为7.20，DO为40％，转速为80rpm；步骤2：制苗用种毒的制备将在生物反应器中培养的LMH-s细胞接种禽腺病毒，然后加入维持液，接毒后继续培养；LMH-s细胞溶液与接种禽腺病毒的体积比为1％；LMH-s细胞溶液与维持液的体积比为50％；所述维持液为含血清1％的DMEM溶液，pH为7.20；接毒后在细胞培养33h时补加5mg/L的TPCK-胰酶；在细胞培养约48h时取病毒液测定TCID50，之后每隔12h取样检测一次，至接毒后96h，将收获的病毒液进行无菌检验和效力检验，合格后作为生产用种毒；所述TPCK-胰酶为浓度为1.25mg/L的胰酶溶液，胰酶溶液的溶剂为体积比例为90％的DMEM和体积比例为10％的FBS的混合液；步骤3：LMH-s细胞在生物反应器中的全悬浮培养取转瓶上生长良好的LMH-s细胞计数后接种到生物反应器中，进行生物反应器全悬浮培养；细胞培养72h后，按体积比1％接种步骤2的毒种，打入总体积50％的维持液，按照步骤2继续培养；起始细胞密度调整为0.5×106个cells/ml，生物反应器设定如下参数温度37℃、pH7.2、搅拌速度80rpm、溶氧含量40％进行反应器自动控制培养；步骤4：病毒的收获与效价检测维持液培养后约72h后停止搅拌，此时将培养液全部收获，冻融一次后保存。将以上本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种I群4型禽腺病毒全悬浮的培养方法，其特征在于，包括：步骤1：制苗用细胞的传代与接种将驯化的全悬浮LMH‑s细胞复苏、传代培养后取样计数，用含10％FBS的DMEM生长液将LMH‑s细胞调整为0.5×10

【技术特征摘要】
1.一种I群4型禽腺病毒全悬浮的培养方法，其特征在于，包括：步骤1：制苗用细胞的传代与接种将驯化的全悬浮LMH-s细胞复苏、传代培养后取样计数，用含10％FBS的DMEM生长液将LMH-s细胞调整为0.5×106个cells/ml，再接种到生物反应器上进行培养；步骤2：制苗用种毒的制备将在生物反应器中培养的LMH-s细胞接种禽腺病毒，然后加入维持液，接毒后继续培养；接毒后细胞培养一段时间后补加TPCK-胰酶；在细胞培养48h时取病毒液测定TCID50，之后每隔12h取样检测一次，至接毒后96h，将收获的病毒液进行无菌检验和效力检验，作为生产用种毒；步骤3：禽腺病毒在生物反应器中的全悬浮培养取生长良好的LMH-s细胞计数后接种到生物反应器中，进行生物反应器全悬浮培养；细胞培养后72h后，按体积比1-2％接种步骤2的毒种，打入总体积50％的维持液，按步骤2继续培养；步骤4：病毒的收获与效价检测维持液培养后约72h后停止搅拌，此时将培养液全部收获，冻融一次后保存。2.根据权利要求1所述的I群4型禽腺病毒全悬浮的培养方法，其特征在于，所述步骤1中，生物反应器容积为2L-200L，生物反应器在使用前需要进行电极校正、灭菌、平衡，具体方法如下；(1)生物反应器的准备：根据培养的体积选择合适的生物反应器，连接好各种管道和补料，换液的接口，接上温度、pH、DO电极，对电极进行校正；(2)气密性检查：反应器中装入适量的PBS，通关闭出气口，向罐内补气，停止补气后看压力维持情况，检查罐体和连接瓶的气密性；(3)灭菌：灭菌前认真检查各管道和接头确保连接完好...

【专利技术属性】
技术研发人员：董婷婷，徐宏军，杨碧涛，李义星，张孝智，姜磊，王麒文，肖龙，张敏，高杰，
申请(专利权)人：青岛蔚蓝生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37