一种活病毒流感疫苗的生产方法以及制剂技术

本发明专利技术涉及一种新型流感病毒疫苗的生产方法。所述流感病毒疫苗基于病毒拯救方式得到并经细胞基质中进一步繁殖获得。所述拯救包括如下步骤：提供稳定整合并表达部分流感病毒基因的细胞株，将相应基因中分别引入终止密码子的流感病毒拯救系统导入所述细胞株，实现病毒拯救，并以所述稳定整合外源基因的细胞株为细胞基质大量生产流感病毒疫苗。本发明专利技术进一步提供经优化的所述流感病毒疫苗生产方法。

Production method and preparation of a live virus influenza vaccine

【技术实现步骤摘要】
一种活病毒流感疫苗的生产方法以及制剂
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种活病毒流感疫苗的生产方法。
技术介绍
流行性感冒(流感)是由流感病毒(Influenzavirus)导致的呼吸道和其他脏器的疾病，在健康儿童和成人中，每年均会在春冬季，甚至其它季节有不同程度的流行，通常是一种急性、传染性的疾病。流感病毒是导致流感的病原体，属于负链单股RNA病毒，其基因组共有8个独立的RNA片段(分别以片段1-8命名)组成，核酸总长度约为13.6kb。这8个片段共编码10种蛋白质，其中8种为结构蛋白，包括PB1、PB2、PA、HA、NA、NP、M1、M2,而NS1、NS2为非结构蛋白。流感病毒分为人流感病毒和动物流感病毒，人流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型。病毒复制主要依靠病毒核糖核蛋白(vRNPs)。甲型流感病毒的核糖核蛋白由病毒RNA、RNA聚合酶(RdRp)复合体以及核蛋白(NP)组成，是病毒的最小复制单位，病毒蛋白在该结构基础上才能表达。vRNPs结构中的RdRp由3个亚基(PA、PB2、PB1)组成，PB1位于三聚体的核心，其N末端和C末端分别与PA亚基的C末端以及PB2亚基的N末端通过非共价键(如疏水作用、氢键、范德华力等)形成稳定的蛋白质复合物。尽管治疗流感病毒可以使用各类抗病毒药物，但由于流感病毒快速变异，世界各地每年有流感的散发流行和暴发，正确接种流感疫苗可以有效的减少流感发病率。目前，流感疫苗按照其种类可分为：全病毒灭活疫苗、裂解疫苗和亚单位疫苗。流感全病毒灭活疫苗具有较高的免疫原性和相对较低的生产成本，但是在接种过程中副反应发生率也较高，同时不得应用于6岁以下儿童，这些都限制了流感全病毒疫苗的应用；裂解疫苗是建立在流感全病毒灭活疫苗的基础上，通过选择适当的裂解剂和裂解条件裂解流感病毒，纯化去除病毒核酸和大分子蛋白，保留抗原有效成分HA和NA以及部分M蛋白和NP蛋白制备而成，裂解型流感疫苗可降低全病毒灭活疫苗的接种副反应，并保持相对较高的免疫原性，可扩大疫苗的使用范围，但在制备过程中须添加和去除裂解剂，而且在裂解过程中导致大量抗原丢失，导致流感疫苗保护效率降低；在裂解疫苗的基础上，又研制出了毒粒亚单位和表面抗原(HA和NA)疫苗；亚单位型流感疫苗具有很纯的抗原组分，但流感疫苗变异很快，因此预防效果上受到了一定的影响。此外，全病毒灭活疫苗、裂解疫苗，因流感快速变异，需要每年在爆发季节前，对当年可能爆发的毒株进行预测，准确预测有一定难度，预测错误，将导致疫苗保护率大幅度下降，而且，即便准确预测，也因为目前主要采用的鸡胚生产工艺，病毒产生的鸡胚适应性变异，导致疫苗保护效率不高；对于亚单位疫苗，由于目前并没有发现流感病毒可以用于疫苗的保守序列，导致进展缓慢。在生产方法方面，传统的制备流感病毒疫苗的方法是使用鸡胚制备。然而，利用鸡胚制备的流感疫苗尚存在生产技术以及安全上的问题。例如，培养周期过长，病毒在培养过程中产生的变异性，劳动强度大，效率低，生产成本高，不易于控制产量，并且鸡胚不同批次间的差异大，不利于扩大生产，以用于应对大规模的流感爆发；另一方面，鸡胚自身被细菌或其他病毒污染而致生产的疫苗存在质量及安全隐患，并且生产疫苗后的废胚数量多，无害化处理难度大，涉及生物安全和公共卫生问题。因此，迫切需要更具有安全性并更好的保留全病毒免疫活性的流感疫苗及其生产方法的问世。此外，尽管通过病毒拯救的方式可以实现病毒在特定宿主细胞中的装配，但该方法仅适合于实验室研究阶段，需要开发利用已装配的病毒细胞不断复制增殖的生产系统，以实现大规模低成本的疫苗生产。
技术实现思路
本专利技术的目的在于通过特定哺乳动物细胞及病毒拯救系统生产流感病毒疫苗，并进一步优化流感疫苗的生产工艺。所述流感病毒由于引入突变而不能在正常哺乳动物细胞中增殖，只能在整合了外源病毒蛋白基因的宿主细胞中增殖。为达到上述目的，本专利技术向哺乳动物细胞中转入特定的基因，获得稳定表达相应的流感病毒蛋白的宿主细胞，再转染相关基因突变后的流感病毒拯救系统，拯救获得复制可控的新型流感活病毒。为获得病毒效价和安全性均符合疫苗制剂要求的活病毒疫苗，本专利技术进一步优化了疫苗生产工艺，并同时获得相应制剂。具体而言，本专利技术提供如下技术方案：第一方面，本专利技术涉及一种活病毒流感疫苗的生产方法，包括如下步骤：(1)通过流感病毒拯救系统转染宿主细胞实现病毒拯救；(2)收获病毒液；(3)将病毒液转入细胞基质中进行复制增殖，以及(4)分离纯化所获得的病毒液；其中，所述流感病毒拯救系统含有突变型PA、PB1、PB2和NP基因，所述突变使得流感病毒拯救系统不能在天然哺乳动物细胞中拯救获得完整病毒；所述步骤(1)的未经转染的宿主细胞和步骤(3)的细胞基质均为稳定表达流感病毒PA、PB1、PB2和NP基因的哺乳动物细胞。优选的，所述流感病毒拯救系统包括编码突变型PA、PB1、PB2和NP基因的重组质粒以及编码HA、NA、M、NS四种基因的重组质粒，所述突变通过分别在四个基因序列中引入TAG密码子实现；优选的，宿主细胞中稳定表达的流感病毒PA、PB1、PB2和NP基因以及流感病毒拯救系统中的HA、NA、M、NS基因均来源于流感病毒H1N1的A/WSN/1933株；优选的，所述流感病毒PA、PB1、PB2和NP基因的核苷酸序列分别如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示；流感病毒拯救系统所含有的PA基因存在R266密码子突变为TAG、PB1基因存在R52密码子突变为TAG、PB2基因存在K33密码子突变为TAG和NP基因存在D101密码子突变为TAG。作为本专利技术病毒扩增步骤的优选方案，步骤(3)按如下方式进行：将细胞基质按照每皿1.0×105-3.0×105个/ml铺板于10cm皿平板中，混匀后，放置于33-38℃，5％CO2，培养20-24hrs至细胞汇合度20％-40％；吸出原培养液，加入10mL新鲜配制的步骤(2)的病毒稀释液，放入33-38℃，5％CO2培养箱中培养，第4天起，每两天补液初始体积的10％培养基，每天观察记录细胞的生长情况以及细胞病变的情况，出现70％以上病变，即可收获病毒液。作为本专利技术病毒分离步骤的优选方案，步骤(4)按如下方式进行：将病毒液分装于高速离心管中，4℃，离心力为100,000g，离心时间为2hrs；或者，将病毒液通过750KD超滤柱浓缩。为进一步优化生产工艺，本专利技术提供了细胞基质的优化培养基成分。所述培养基优选为DMEM培养基，并优选为经过改造的DMEM培养基，其中血清浓度为1％，TPCK浓度为2μg/ml。本专利技术的另一方面涉及依照上述方法制备的活病毒流感疫苗。本专利技术的又一方面涉及将上述方法生产获得的活病毒流感疫苗制成制剂。该制剂优选含有1～100×107pfu/ml的流感病毒，并含有以重量百分比计的如下组分：0.1-0.5％海藻糖或壳聚糖，0.1-0.3％明胶，0.2-0.8％蔗糖，0.1-0.3％乳胶蛋白和0.1-0.8％白蛋白，余量为水。更优选的，上述制剂可以进一步制成如下剂型，包括但不限于滴鼻剂、注射剂或透皮剂。作为优选方案，所述注射剂不加佐剂并用PBS重悬制备而成，所述透皮剂通过加入10-20％本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种活病毒流感疫苗的生产方法，包括如下步骤：(1)通过流感病毒拯救系统转染宿主细胞实现病毒拯救；(2)收获病毒液；(3)将病毒液转入细胞基质中进行复制增殖，以及(4)分离纯化所获得的病毒液；其特征在于，所述流感病毒拯救系统含有突变型PA、PB1、PB2和NP基因，所述突变使得流感病毒拯救系统不能在天然哺乳动物细胞中拯救获得完整病毒；所述步骤(1)的未经转染的宿主细胞和步骤(3)的细胞基质均使用稳定表达流感病毒PA、PB1、PB2和NP基因的哺乳动物细胞。

【技术特征摘要】
1.一种活病毒流感疫苗的生产方法，包括如下步骤：(1)通过流感病毒拯救系统转染宿主细胞实现病毒拯救；(2)收获病毒液；(3)将病毒液转入细胞基质中进行复制增殖，以及(4)分离纯化所获得的病毒液；其特征在于，所述流感病毒拯救系统含有突变型PA、PB1、PB2和NP基因，所述突变使得流感病毒拯救系统不能在天然哺乳动物细胞中拯救获得完整病毒；所述步骤(1)的未经转染的宿主细胞和步骤(3)的细胞基质均使用稳定表达流感病毒PA、PB1、PB2和NP基因的哺乳动物细胞。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流感病毒拯救系统包括编码突变型PA、PB1、PB2和NP基因的重组质粒以及编码HA、NA、M、NS四种基因的重组质粒，所述突变通过分别在四个基因序列中引入TAG密码子实现；优选的，宿主细胞中稳定表达的流感病毒PA、PB1、PB2和NP基因以及流感病毒拯救系统中的HA、NA、M、NS基因均来源于流感病毒H1N1的A/WSN/1933株。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述流感病毒PA、PB1、PB2和NP基因的核苷酸序列分别如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示；流感病毒拯救系统所含有的PA基因存在R266密码子突变为TAG、PB1基因存在R52密码子突变为TAG、PB2基因存...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴东升，张文捷，李会强，周德敏，马闻箫，
申请(专利权)人：浙江森卫生物医药发展有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33