本发明专利技术公开了一株一株高产赤霉素GA3的藤仓赤霉菌突变株——水稻恶苗病菌GA‑251及其应用；所述水稻恶苗病菌GA‑251(Fusarium fujikuroi GA‑251)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，邮编430072，保藏编号：CCTCC NO：M 2019201，保藏日期2019年3月25日。该菌株通过氯化锂和钴60辐射复合诱变原生质体获得，该菌株产赤霉素GA3提高20％。本方法具有效价高，终产物易于提取等优点，克服了原工艺发酵效价低、成本高的缺点。
Mutant strain of Gibberellin GA3-producing Fujikura and its application
【技术实现步骤摘要】
高产赤霉素GA3的藤仓赤霉菌突变株及其应用(一)
本专利技术涉及一株高产赤霉素GA3的藤仓赤霉菌突变株——水稻恶苗病菌GA-251及其应用。(二)
技术介绍
赤霉素(Gibbeerllins，GAs)是一种植物激素，广泛应用于农、林、园艺、食品酿造等诸多领域。其制备方法主要有植物提取法、化学法、微生物发酵法，然而微生物发酵法因其具有生产成本低和对环境污染小等优点，具有广阔的工业应用前景。霉素最早是由日本植物病理学家KenkichiSawada在研究水稻恶苗病中发现的，后来他的同事EiichiKurosawa证实了这一点，他于1926年发表了一篇论文，表明这种疾病的症状可以通过应用无菌真菌培养物来复制，他发现这些分泌物也会刺激除水稻以外的几种幼苗的生长。这一具有里程碑意义的出版物随后出现了大量有关分泌物质特性的报告，1935年，东京大学农业化学教授化学家TeijiroYabuta获得了具有高生物活性的纯化样品，称为赤霉素。赤霉素可促进种子发芽、植物生长使蔬菜水果增产；可作为植物生长调节剂，促进作物生长发育；拥有雌激素样活性，在发制品中能促进头皮血液循环。赤霉素GA3是一种二萜类酸，分子式C19H22O6，分子量346.37，熔点233-235℃，易溶于醇类、丙酮、乙酸乙酯、碳酸氢钠溶液及pH为6.2的磷酸缓冲液，难溶于水和乙醚。GAs生物合成从GGDP开始经由异戊烯二磷酸(IPP)，在经过两次环化步骤从GGDP经由焦磷酸古巴酯(CPP)后，产生了贝壳杉烯。通过贝壳杉烯醇和贝壳杉烯醛在C-19上氧化产生贝壳杉烯酸，后氧化收缩，形成GA12-醛。GA12-醛羟基化生成GA14-醛，然后在C-7位氧化形成GA14，GA14通过氧化转化为GA4，GA4经去饱作用生成GA7，然后通过羟基化转化为GA3。1970年来我国筛选到高产变种“4303”，不过该菌无产孢子能力，且为多核菌丝，使继续选育十分困难。目前的生产效价呈现出徘徊不前的状态，而且有的生产菌种出现退化。中国的专利技术专利(公开号CN104892554A)描述了关于赤霉素GA3的制备方法，但未有报道高产赤霉素的藤仓赤霉菌及其应用，传统的菌株在产量上一直在1.8g～2g之间徘徊，有待于进一步提升。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种高产赤霉素GA3的藤仓赤霉菌突变株——水稻恶苗病菌GA-251及其应用，该菌株可应用于工业化生产，在相同培养成本的条件下有更高的产素能力，可为工业化生产提供利润，在发酵后期杂质少，可减少提取分离工作。本专利技术采用的技术方案是：一株高产赤霉素GA3的藤仓赤霉菌突变株——水稻恶苗病菌GA-251(FusariumfujikuroiGA-251)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，邮编430072，保藏编号：CCTCCNO：M2019201，保藏日期2019年3月25日。本专利技术菌株的获得过程如下：1、制备原生质体，具体方法参照朱廷恒等赤霉菌原生质体外源基因高效转化方法研究(浙江工业大学学报，2013，41(5)，482-485)2、通过钴60-γ射线(Co60γ-射线)、氯化锂单因素诱变和复合诱变得到藤仓赤霉菌GA-251。所述水稻恶苗病菌GA-251的18srDNA序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还涉及所述的水稻恶苗病菌GA-251在微生物发酵制备赤霉素中的应用。具体的，所述水稻恶苗病菌GA-251用于微生物发酵制备赤霉素GA3。具体的，所述应用为：将所述水稻恶苗病菌GA-25接种至发酵培养基，20～30℃、200～300rpm条件下发酵培养12～48h，获得含赤霉素GA3的发酵液，发酵液经分离纯化获得赤霉素GA3。所述发酵培养基组成如下：玉米淀粉60～90g/L，米粉70～100g/L，大豆粉3～7g/L，花生粉3～7g/L，K2SO40.3～0.7g/L，KH2PO40.3～0.7g/L，溶剂为水，pH自然，121度灭菌30min。优选的，所述水稻恶苗病菌GA-25先接种至斜面培养基，活化后的菌株接种至种子培养基经种子培养获得种子液再接种至发酵培养基，所述斜面培养基组成如下：土豆150～200g/L、蔗糖10～30g/L、硫酸镁0.1～0.3g/L、碳酸钙0.1～0.3g/L、琼脂20g/L，pH自然，115℃灭菌30min；所述种子培养基组成如下：玉米淀粉10～30g/L、蔗糖10～30g/L、花生粉10～30g/L、大豆粉10～30g/L、磷酸二氢钾0.5～1.5g/L、硫酸镁0.5～1.5g/L，pH自然，121℃灭菌30min。本专利技术有益效果主要体现在：1、本专利技术提供一株高产赤霉素的藤仓赤霉菌突变株，该菌株生长过程中不产生分生孢子；2、本专利技术提供一种赤霉素GA3的发酵方法，该方法采用可产生赤霉素GA3；本专利技术菌株接种到液体种子培养基中，待细胞长成熟后，转接到发酵培养基中，发酵水平大幅度提高，赤霉素产率达到野生菌的21倍，为国际领先。赤霉素在胞外分泌，可直接从发酵液汇总获取，有利于固液分离，提取收率升高。同时，提高了设备和原料的利用率，大大降低了生产成本，具有显著的经济效益与社会效益；3、采用本专利技术，能在现有制药生产设备上实施，无额外投资。(四)附图说明图1为菌株18SrDNA序列PCR扩增argrose电泳图。图2为电镜观察下的菌丝体形态。图3为发酵液中GA3含量变化。图4为发酵液中pH变化。图5为GA-251发酵干重变化。图6为GA3高效液相色谱(HPLC)检测标准曲线。图7为不同发酵温度对菌株GA-251GA3产生的影响(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：实施例1：野生藤仓赤霉菌原生质体制备(1)斜面的制备：将野生藤仓赤霉菌菌株接种至斜面培养基中，28℃培养3～7天，待气生菌丝长满斜面可转接至种子液。(2)种子液的制备：挑取步骤(1)中的一小块菌接种至种子培养基中，28℃，250rpm培养48h，获得种子液。种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉20g/L、蔗糖20g/L、花生粉20g/L、大豆粉20g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、硫酸镁1.0g/L，溶剂为自来水，pH自然，121℃灭菌30min。(3)发酵培养250mL规格摇瓶装样40mL发酵培养基，发酵时按体积浓度1-4％接种种子液，28℃，250rpm发酵培养168h。发酵培养基组成：玉米淀粉80g/L，米粉80g/L，大豆粉5g/L，花生粉5g/L，K2SO40.5g/L，KH2PO40.5g/L，溶剂为自来水，pH自然，121度灭菌30min。(4)原生质体制备从斜面接种一小菌块至YEPD液体培养基(酵母提取物0.3％、蛋白胨1％、葡萄糖2％，溶剂为水)中，28℃、180rpm培养48个小时。取2ml菌液加入无菌Eppendorf管中，先后用无菌水、1MMgSO4各洗涤一次。用灭菌枪头蘸取少量菌丝至已过滤除菌的1.5mL破壁缓冲液(1MMgSO4、总酶浓度为15mg/mL，其中Dryslase：Yatalase＝3:7)中，吹打均匀，置于30℃水浴摇床中反应45分钟(原生质体产生率在95％以上)。5000rpm离心10分钟，转移上清0.75mL至另一离心管，加入等量的无菌水，混本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一株高产赤霉素GA3的藤仓赤霉菌突变株——水稻恶苗病菌GA‑251(Fusarium fujikuroi GA‑251)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，邮编430072，保藏编号：CCTCC NO：M 2019201，保藏日期2019年3月25日。
【技术特征摘要】
1.一株高产赤霉素GA3的藤仓赤霉菌突变株——水稻恶苗病菌GA-251(FusariumfujikuroiGA-251)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，邮编430072，保藏编号：CCTCCNO：M2019201，保藏日期2019年3月25日。2.如权利要求1所述的水稻恶苗病菌GA-251，其特征在于所述水稻恶苗病菌GA-251的18srDNA序列如SEQIDNO.1所示。3.权利要求1所述的水稻恶苗病菌GA-251在微生物发酵制备赤霉素中的应用。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述水稻恶苗病菌GA-251用于微生物发酵制备赤霉素GA3。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述应用为：将所述水稻恶苗病菌GA-25接种至发酵培养基，20～30℃、200～300rpm条件下发酵培养12～48h，获得含赤霉素GA3的发酵液，发酵液经分离纯化获得赤霉素GA3。6.如...
【专利技术属性】
技术研发人员：柳志强，张博，蒋欢，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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