一种阻断鸡禽白血病病毒垂直传播的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种阻断鸡禽白血病病毒垂直传播的方法及其应用，发明专利技术人首次发现禽白血病病毒的垂直传递是由禽白血病阳性鸡的生殖系统来源的外泌体携带、介导并且感染受体鸡和后代小鸡的，提供了一种通过干预禽白血病阳性公鸡的精液外泌体从而阻断ALV垂直传播的方法和阻断剂。其有益效果在于，本发明专利技术所公开的与禽白血病病毒垂直传播相关的外泌体为治疗或预防禽白血病提供了新靶点，并且提供的阻断方法不受毒株亚群、变异的影响，从传播途径进行统一切断，针对范围广，方法简单快速，效果好。

【技术实现步骤摘要】
一种阻断鸡禽白血病病毒垂直传播的方法及其应用
本专利技术属于动物医学
，更具体地，涉及一种阻断鸡禽白血病病毒垂直传播的方法及其应用。
技术介绍
禽白血病是由反转录病毒科、α反转录病毒属的禽白血病病毒(AvianLeukosisVirus，ALV)及肉瘤病毒群引起的禽类多种肿瘤性疾病的统称，ALV引起的禽类造血组织中某些细胞成分过度增生为主的肿瘤性疾病，包括髓细胞性白血病、成髓细胞白血病、成红细胞性白血病和淋巴细胞性白血病，是威胁世界养禽业的主要疾病之一，给世界养禽业带来巨大损失。将禽白血病/肉瘤病毒群病毒划分为A-K11个亚群，感染鸡的禽白血病病毒包括ALVA-E、J和K共7个亚群。J亚群具有感染率高、传播速度快、宿主范围广、致死率高等特点，给养禽业造成了严重的危害和巨大的经济损失，引起了国内外兽医界的高度重视。ALV-J水平传播感染情况与鸡的年龄水平传播感染情况与鸡的年龄相关，较小年龄的禽类接触病毒后倾向于产生耐受的病毒血症，并大几率发生肿瘤；而在较老年龄的禽类接触病毒导致其产生免疫，可能会或不释放病毒。垂直传播垂是ALV-J发生的主要途径。垂直传播主要是指亲本鸡的体内病毒通过种蛋传给下一代。垂直传播的的存在，使得淋巴白血病在鸡群中世代存在提供了途径。而母鸡较公鸡更容易发生淋巴白血病，因此，切断垂直传播途径尤为重要。目前国内外尚无可有效防治J亚群禽白血病的药物和商品化疫苗，仅能通过淘汰阳性鸡、加强生物安全措施以达到控制的目的。减少种鸡群的感染率和建立无白血病的种鸡群是控制本病的最有效措施。种鸡在育成期和产蛋期各进行2次检测，淘汰阳性鸡。从蛋清和阴道拭子试验阴性的母鸡选择受精蛋进行孵化，在隔离条件下出雏、饲养，连续进行4代，建立无病鸡群。但由于费时长、成本高、技术复杂，一般种鸡场还难以实行。
技术实现思路
本专利技术针对于以上问题，提供一种简单、快速阻断鸡的禽白血病病毒垂直传播的方法，所述方法为干预禽白血病阳性亲本生殖系统来源的外泌体。本专利技术在研究感染禽白血病鸡的过程中，发现了禽白血病病毒的垂直传播依赖于亲本生殖系统来源的外泌体的参与，禽白血病病毒通过被此类外泌体包裹，运输，进而进入到子代胚体中，又在外泌体的帮助下不断增殖，感染细胞。禽白血病阳性亲本生殖系统来源的外泌体，例如，阳性父本中运输禽白血病病毒的是精液外泌体，精液外泌体主要来源于其生殖细胞，阳性母本运输亲白血病病毒传播的外泌体的主要来源于其生殖道上皮细胞。进一步，所述外泌体为禽白血病阳性父本的精液外泌体。实际生产过程中，垂直传播是ALV发生的主要途径，且专利技术人发现阳性父本即阳性公鸡中精液外泌体中含有禽白血病病毒，且精液外泌体还是介导该类病毒从亲代传递到子代的重要载体。进一步，所述干预为人工受精时，封闭或阻断禽白血病阳性父本的精液外泌体。本专利技术所提供的方法是干预参与运输所述禽白血病病毒的外泌体的功能，而阻断该传播途径，特别是，当亲本中父本为感染者或携带者时，只需在人工授精时，将其精液外泌体封闭或阻断，即可达到干预目的。进一步，所述禽白血病病毒为ALV-A、ALV-B、ALV-C、ALV-D、ALV-E、ALV-J或ALV-K的一种或多种。进一步，所述禽白血病病毒为ALV-J时，是本专利技术一个较优的实施方式，但并不局限于该亚群的病毒。本专利技术同时保护所述阻断鸡的禽白血病病毒垂直传播的方法在鸡抗病育种中的应用。本专利技术所提供的阻断鸡的禽白血病病毒垂直传播的方法，能够提高种公鸡利用率，ALV目前没有疫苗，生产上，很多具有优越生产性能的种公鸡一旦感染ALV，只能淘汰，人工受精的过程中阻断精液外泌体，可以阻断禽白血病病毒经公鸡精液垂直传播，对高生产性能种公鸡和濒危品种尤为重要；此外，能够减少生产环节，提高生产效率，生产过程中，个体感染情况具有一定的不确定性，常出现假阳性或假阴性，造成潜在ALV传播，增加生产工作量和感染风险，需要不断净化和淘汰，本专利技术所述阻断方法，可以阻断禽白血病病毒经公鸡精液垂直传播，更方便快速的杜绝这种潜在威胁。本专利技术公开一种鸡的禽白血病病毒垂直传播的阻断剂，所述阻断剂为外泌体的封闭物。利用外泌体封闭物将外泌体及其包裹在内的物质封存，阻止外泌体被目的细胞所吸收，进而阻止包裹于内的病毒遗传信息的释放。进一步，所述封闭物包括外泌体抗体。进一步，所述外泌体抗体为外泌体的跨膜蛋白抗体或热休克蛋白抗体中的一种或多种。外泌体有由磷脂双分子层组成的胞外膜泡状结构，研究表明，外泌体跨膜蛋白与病毒入侵、肿瘤进展相关同时也与病毒介导的细胞融合相关，封闭这些蛋白，能够干预外泌体功能，从而抑制病毒的入侵、融合或增殖，起到阻断病毒的作用。进一步，所述跨膜蛋白为CD9、CD63或CD81的一种或多种，所述热休克蛋白为HSP70。本专利技术的研究过程中发现，在精液中添加CD9、CD63、CD81和/或HSP70能有效抑制禽白血病病毒的复制和表达，从而阻断该病毒在子代细胞中增殖和传播。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下方案予以实现的：专利技术人通过外泌体RNA的高通量测序和RT-PCR与WesternBlot的检测，发现阳性精液外泌体可以携带病毒的遗传物质，并且可以体外感染DF-1细胞，在实际生产中，专利技术人用人工授精的方法模拟外泌体在垂直传播中的作用，验证了阳性公鸡的精液外泌体能够携带病毒成分感染母鸡，并且通过鸡蛋感染后代小鸡，并且通过封闭外泌体的跨膜蛋白，限制了ALV在细胞内的增殖，从而阻断了外泌体介导的ALV对母鸡和小鸡的感染。相对于现有技术，本专利技术具有如下的优点及效果：(1)本专利技术首次发现外泌体抗体可以结合到精液外泌体细胞膜上，抑制外泌体中ALV病毒的传播，从而抑制精液中ALV的感染能力，进而阻断禽白血病病毒经公鸡精液垂直传播，为治疗或预防禽白血病提供了新靶点；(2)提高种公鸡利用率，ALV目前没有疫苗，生产上，很多具有优越生产性能的种公鸡一旦感染ALV，只能淘汰，本专利技术所使用的方法可以阻断禽白血病病毒经公鸡精液垂直传播，对高生产性能种公鸡和濒危品种尤为重要；(3)减少生产环节，提高生产效率，生产过程中，个体感染情况具有一定的不确定性，常出现假阳性或假阴性，造成潜在ALV传播，增加生产工作量和感染风险，需要不断净化和淘汰，本专利技术的阻断方法可以阻断禽白血病病毒经公鸡精液垂直传播，因此能很好的杜绝这种潜在威胁；(4)ALV易发生变异，很难针对各种亚群或变异型研发有统一功效的疫苗，而本专利技术所提供的方法不受毒株亚群、变异的影响，从传播途径进行统一切断，针对范围广，方法简单快速，效果好。附图说明图1为精液外泌体电镜下形态，其中A：8600×的视野观察；B：14000×的视野观察；C：18000×的视野观察。图2为外泌体的标记蛋白westernblot结果图。图3为外泌体的病毒全基因组分段扩增。图4为western检测外泌体的病毒蛋白表达情况图。图5为用10nm胶体金颗粒标记gp85蛋白的免疫电镜照片。图6为ALV-J特异性扩增图，其中M：DL2000marker，1：阴性对照，2：control，3：PBS4：50μg外泌体5：100μg外泌体。图7为阳性外泌体感染细胞后病毒蛋白表达。图8为不同封闭物对病毒增殖的抑制作用。图9为不同封闭物对病毒蛋白表达的抑制作用。图10为D组本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种阻断鸡的禽白血病病毒垂直传播的方法，其特征在于，所述方法为干预禽白血病阳性亲本生殖系统来源的外泌体。

【技术特征摘要】
1.一种阻断鸡的禽白血病病毒垂直传播的方法，其特征在于，所述方法为干预禽白血病阳性亲本生殖系统来源的外泌体。2.根据权利要求1所述阻断鸡的禽白血病病毒垂直传播的方法，其特征在于，所述外泌体为禽白血病阳性父本的精液外泌体。3.根据权利要求1所述阻断鸡的禽白血病垂直传播的方法，其特征在于，所述干预为人工授精时，封闭或阻断禽白血病阳性父本的精液外泌体。4.根据权利要求1所述阻断鸡的禽白血病病毒垂直传播的方法，其特征在于，所述禽白血病病毒为ALV-A、ALV-B、ALV-C、ALV-D、ALV-E、ALV-J或ALV-K中的一种或多种。5.根据权利要求1所述阻断鸡的禽白血病病毒垂直传播的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢青梅，廖立钦，陈伟国，蔺文成，张新珩，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44