提高的衣康酸生产制造技术

本发明专利技术涉及通过抑制衣康酰‑CoA转移酶、衣康酰‑CoA水合酶(柠苹酰‑CoA水解酶；EC 4.2.1.56)和/或柠苹酰‑CoA裂解酶的表达或功能来增加微生物体中衣康酸生产的方法。还体现了微生物，优选土曲霉或黑曲霉，其中所述酶被抑制。

Improvement of itaconic acid production

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】提高的衣康酸生产本专利技术涉及微生物生产领域，更具体地涉及衣康酸(衣康酸盐)的生产，更具体地涉及真菌中的衣康酸盐生产。数十年来，衣康酸在微生物细胞中的生产和代谢已被广泛研究(Calam，C.T.等人，1939，Thom.J.Biochem.，33：1488-1495；Bentley，R.和Thiessen，C.P.，1956，J.Biol.Chem.226∶673-720；Cooper，R.A.和Kornberg，H.L.，1964，Biochem.J.，91：82-91；Bonnarme，P.等人，1995，J.Bacteriol.117：3573-3578；Dwiarti，L.等人，2002，J.Biosci.Bioeng.1：29-33)，但衣康酸的代谢途径尚未明确地确定(Wilke，Th.和Vorlop，K.-D.，2001，Appl.Microbiol.Biotechnol.56：289-295；Bonnarme，P.等人，1995，J.Bacteriol.177：3573-3578)。在这方面的两个复杂因素是：衣康酸的生物合成途径被认为在细胞溶质和线粒体中发生(Jaklitsch，W.M.等人，1991，J.Gen.Microbiol.Appl.6：51-61)，以及已发现顺乌头酸酶(一种将柠檬酸互变为顺式乌头酸且反之亦然的酶)以及代谢途径中的其他酶在微生物细胞中以许多同种型存在。衣康酸生产现在在土曲霉(Aspergillusterreus)中实现商业化，所述土曲霉与黑曲霉(Aspergillusniger)和米曲霉(A.oryzae)具有生理相似性。然而，后两者由于缺乏顺式乌头酸脱羧酶(CAD)活性而累积柠檬酸。这些真菌所使用的底物包括单糖和二糖，诸如葡萄糖、蔗糖和果糖以及淀粉(因为它们以可被微生物体降解的形式存在)、以及糖蜜。最近，已发现甘油也是土曲霉在衣康酸生产中的有用的底物(US5,637,485)。目前设想用于衣康酸生物合成的一般方案在图21中给出，其中明确描述了在胞质溶胶和线粒体中均存在生物合成途径，以及这两个隔室间的连接。在该方案的数个方面存在尝试改善微生物体中衣康酸的现有商业生产的可能性。专利技术概述本专利技术人现已发现所选用于增加衣康酸抗性和降低衣康酸降解和/或生化转化的突变体菌株，因此产生了提高水平的衣康酸。此外，本专利技术人已发现抑制衣康酰-CoA转移酶(EC2.8.3.-)、衣康酰-CoA水合酶/柠苹酰-CoA水解酶(EC4.2.1.56)或柠苹酰-CoA裂解酶(EC4.1.3.25)的活性和/或抑制产生衣康酸的生物体(如曲霉属)中编码这些酶的基因的表达，能够克服由衣康酸引起的毒性作用并同时促进衣康酸生产。因此，本专利技术包括通过增加对衣康酸的毒性作用的抗性和降低衣康酸降解和/或生化转化来增加微生物体中衣康酸生产的方法。一种获得增加的衣康酸生产的方法是通过选择对衣康酸的毒性作用具有抗性的衣康酸生产生物体的突变体菌株。另一种方法是通过抑制酶衣康酰-CoA转移酶(EC2.8.3.-)和/或衣康酰-CoA水合酶(柠苹酰-CoA水解酶，EC4.2.1.56)和/或柠苹酰-CoA裂解酶(EC4.1.3.25)的功能或抑制编码这些酶的基因的表达。所述抑制可通过编码所述衣康酰-CoA转移酶和/或衣康酰-CoA水合酶(柠苹酰-CoA水解酶)和/或柠苹酰-CoA裂解酶(EC4.1.3.25)的基因的突变来实现，其中所述突变选自：a)启动子突变或诱导型启动子插入；b)编码序列突变，其选自一个或多个核苷酸的插入、缺失或改变；c)蛋白结合位点插入；和d)它们的组合。在一个可替代的实施方案中，所述酶的表达被沉默，其可通过以下实现：a)反义沉默；b)有义共遏制(senseco-suppression)；或c)RNA干扰。本专利技术进一步包括了根据上述中任一项所述的方法，其中所述微生物体是天然生产衣康酸的微生物体，其中任选地，所述微生物体还提供有编码顺乌头酸酶的基因和/或编码柠檬酸合酶、2-甲基柠檬酸脱水酶和/或顺式乌头酸脱羧酶的基因。此外，可以将编码可转运顺乌头酸酶(-代谢物)的转运蛋白的基因，诸如土曲霉ATEG_09970.1或ATEG_09972.1添加至衣康酸生产中。可替代地，所述微生物体经遗传构建用以生产衣康酸，优选通过引入编码顺式乌头酸脱羧酶的基因，其中任选地所述微生物体还提供了编码顺乌头酸酶的基因和/或编码柠檬酸合酶和/或2-甲基柠檬酸脱水酶和/或顺乌头酸酶转运蛋白(诸如土曲霉ATEG_09970.1或ATEG_09972.1)的基因。优选地，所述微生物体是曲霉属，优选土曲霉或黑曲霉。本专利技术的另一实施方案是微生物体，优选曲霉属，更优选土曲霉或黑曲霉，其中编码衣康酰-CoA转移酶和/或衣康酰-CoA水合酶(柠苹酰-CoA水解酶)和/或柠苹酰-CoA裂解酶(EC4.1.3.25)的基因的表达受抑制。附图说明图1：土曲霉NRRL1960的受控发酵，显示出衣康酸生产和降解。示出了相对于发酵时间(小时)的葡萄糖浓度(g/l)、衣康酸滴度(g/l)和生物量(gDWT/kg)。图2：产生IA和CA的黑曲霉菌株CitB#77和CitB#101的受控发酵，显示出衣康酸生产和降解。A.衣康酸(IA)滴度和柠檬酸(CA)滴度(g/l)，和B.示出了相对于发酵时间EFT(h)的葡萄糖浓度(g/l)和生物量(g/kg)。图3：来源于工业化的柠檬酸生产菌株的IA生产性黑曲霉菌株Q199(CBS143051)的受控发酵，显示出柠檬酸生产和衣康酸生产和降解。示出了相对于发酵时间EFT(小时)的葡萄糖浓度(g/l)、衣康酸盐滴度(g/l)、柠檬酸盐滴度(g/L)和生物量(gDWT/kg)。图4：AB1.13CAD4.1(CBS141653)菌株在补充有数个浓度的衣康酸的M12+Cu中的生长。没有C源的培养基用作阴性对照。生产培养基中10g/lIA的胞外浓度导致生物量发展减少75％。在33℃下孵育7天后，在20g/lIA生长和甚至更高浓度的IA下观察到进一步恶化的生长。图5：黑曲霉IA生产性菌株CitB#99(CBS141659)和#113(CBS141660)的受控发酵中的有机酸产生和生物量形成，与AB1.13#49B(CBS141657)相比，显示出减少的生物量形成。示出了相对于发酵时间EFT(h)的A.衣康酸(IA)滴度和柠檬酸(CA)滴度(g/l)以及B.葡萄糖浓度(g/l)和生物量(g/kg)。图6：用进化突变体EE#3、#7、#9、#10、#13、#25(CBS141661)和#26(CBS141662)以及CitB#99(CBS141659)进行的摇瓶实验的生物量生成。摇瓶填装有存在和不存在IA的生产培养基。在该实验中使用进化实验突变体菌株及其亲本菌株CitB#99。该实验一式两份进行。在33℃下孵育5天后，示出了相对于发酵条件(+/-IA)的生物量(g/kg)。图7：用进化突变体EE#3、#7、#9、#10、#13、#25(CBS141661)和#26(CBS141662)以及CitB#99(CBS141659)进行的摇瓶实验的平均生长抑制。摇瓶中装有存在和不存在IA的生产培养基。在该实验中使用进化实验突变体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.增加微生物体中衣康酸生产的方法，其通过抑制衣康酰‑CoA转移酶(EC 2.8.3.‑)和/或衣康酰‑CoA水合酶(柠苹酰‑CoA水解酶；EC 4.2.1.56)和/或柠苹酰CoA裂解酶(EC 4.1.3.25)的表达或功能来实现。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.08.26 EP 16185980.61.增加微生物体中衣康酸生产的方法，其通过抑制衣康酰-CoA转移酶(EC2.8.3.-)和/或衣康酰-CoA水合酶(柠苹酰-CoA水解酶；EC4.2.1.56)和/或柠苹酰CoA裂解酶(EC4.1.3.25)的表达或功能来实现。2.如权利要求1所述的方法，其中所述抑制通过编码所述衣康酰-CoA转移酶(EC2.8.3.-)和/或衣康酰-CoA水合酶(柠苹酰-CoA水解酶；EC4.2.1.56)和/或柠苹酰CoA裂解酶(EC4.1.3.25)的基因的突变导致。3.如权利要求2所述的方法，其中所述突变选自：a.启动子突变或诱导型启动子插入；b.编码序列突变，其选自一个或多个核苷酸的插入、缺失或改变；c.蛋白结合位点插入；和d.它们的组合。4.如权利要求3所述的方法，其中所述突变借助CRISPR-Cas9技术实现。5.如权利要求1所述的方法，其中沉默所述酶的表达。6.如权利要求5所述的方法，其中所述沉默通过以下实现：a.CRISPRi技术b.反义沉默；c.有义共遏制；或d.RNA干扰。7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述微生物体是天然生产衣康酸的微生物体，其中任选地所述微生物体还提供有编码顺乌头酸酶的基因和/或编码2-甲基柠檬酸脱水酶的基因。8.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述微生物体经遗传构建以生产衣康酸，优选通过引入编码顺式乌...

【专利技术属性】
技术研发人员：彼得·詹·潘特，
申请(专利权)人：勒萨弗尔公司，
类型：发明
国别省市：法国,FR