用于构建BRCA1/2基因变异检测文库的自动化试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及用于构建BRCA1/2基因变异检测文库的自动化试剂盒。本发明专利技术提供一种用于BRCA1/2基因的扩增子文库构建试剂盒，所述试剂盒包含：1)用于进行第一轮PCR扩增的第一引物，2)用于进行第二轮PCR扩增的第二引物，3)第三引物和第四引物，其用于以第二轮PCR扩增产物为模板进行第三轮PCR扩增，构建目的基因的扩增子文库，其中第一引物和第二引物为BRCA1/2基因的特异性引物，其中上述1)、2)和3)分别置于分开的容器中。本发明专利技术的试剂盒自动化构建扩增子文库，显著降低了操作的繁琐程度和对检测样本的需求量，提高了测序数据的整体质量。

Automated kit for construction of BRCA1/2 gene mutation detection Library

【技术实现步骤摘要】
用于构建BRCA1/2基因变异检测文库的自动化试剂盒
本专利技术涉及用于基因检测文库构建的自动化试剂盒。具体而言，本专利技术涉及用于构建BRCA1/2基因变异检测文库的自动化试剂盒。
技术介绍
耗资30亿美元历时10余年完成的人类基因组计划(HumanGenomeProject，HGP)给基因组学研究带来了天翻地覆的变化，通过测定人类基因组DNA的序列，探寻基因在染色体上的位置，明确基因的结构和功能，解读人类的全部遗传信息，人类第一次在分子水平上全面认识自我。新一代测序技术催生了丰富多彩的基因组图谱。新一代测序技术又称大规模平行测序(massivelyparallelsequencing，MPS)，是指采用“边合成边测序”的原理、对于几十万到几百万DNA分子同时进行平行的测序反应，然后通过生物信息学分析所得到的原始图像数据或电化学信号、最终得到待测样品的核酸序列或拷贝数等信息的测序技术，又称为高通量测序、深度测序等。然而，有些研究并不需要对全基因组进行测序，而只需对特定的基因组区域进行研究。扩增子测序就是通过设计感兴趣的基因组区域的引物，通过PCR扩增，将目标区域DNA富集后进行高通量测序的研究策略。扩增子测序技术通常会使用大量的引物，为了避免大量引物二聚体的生成，常见的方法是将反应体系从一管拆分至多管，从而降低每管反应中引物的数量，减少引物二聚体的生成。但是该方法，大大增加了操作的繁琐程度及检测样本的需求量。同时，目前主要的扩增子建库技术，对目标区域进行扩增时，通常会使用多循环PCR程序，由于不同引物之前扩增效率不同，通过双向引物指数型PCR扩增，经过多循环PCR程序后，扩增区域的均一性会出现显著的差别，最终可能导致测序数据质量整体变差。对于BRCA1/2基因变异检测文库，当前方法均需手工添加各种试剂，构建时间较长，且不易确保实验操作的一致性。另外，如上所述，现有构建方法中需要将反应体系从一管拆分至多管，减少引物二聚体的生成，并且还需考虑不同引物扩增效率的不同导致的扩增区域均一性的显著差别而对PCR过程进行人工干预，难以实现整个构建过程的全自动化。
技术实现思路
专利技术人对当前新一代测序过程使用的扩增子测序技术存在的不足进行针对性研究，提出了新的BRCA1/2基因变异检测文库构建方法，大大缩短了变异检测时整个文库构建流程所需的工作量，同时降低了对样本量的需求。在新的BRCA1/2基因变异检测文库构建方法的基础上，专利技术人进一步设计适合本专利技术方法的整套全自动BRCA1/2基因变异检测文库构建试剂盒，从而实现整个构建实验过程不需要人工干预的真正的全自动文库构建。在一些实施方案中，本专利技术提供一种用于BRCA1/2基因的扩增子文库构建试剂盒，所述试剂盒包含：1)用于进行第一轮PCR扩增的第一引物，2)用于进行第二轮PCR扩增的第二引物，3)第三引物和第四引物，其用于以第二轮PCR扩增产物为模板进行第三轮PCR扩增，构建目的基因的扩增子文库，其中第一引物和第二引物为BRCAl/2基因的特异性引物，其中上述1)、2)和3)分别置于分开的容器中。在一些实施方案中，第一引物和第二引物用于对样本中包含BRCA1/2基因区域进行靶向扩增，所述靶向扩增包括1)以所述样本为模板，通过第一引物进行第一轮PCR扩增，2)以第一轮PCR扩增的产物为模板，通过第二引物进行第二轮PCR扩增。在一些实施方案中，第三引物和第四引物以第二轮PCR扩增产物为模板，通过第三轮PCR扩增构建BRCA1/2基因的扩增子文库。在一些实施方案中，所述样本可以包含来自受试者的基因组DNA或通过反转录获得的cDNA。在一些实施方案中，所述样本可以包含来自受试者的BRCA1/2基因。在一些实施方案中，来自受试者的BRCA1/2基因可以包括野生型BRCA1/2基因或变异BRCA1/2基因。在一些实施方案中，本专利技术的方法中的第一轮PCR扩增和/或第二轮PCR扩增可以进行适当的循环数，例如进行1-10个循环，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10个循环。在一些实施方案中，本专利技术的循环数优选小于10个循环。在一些实施方案中，本专利技术中的第一轮PCR扩增和/或第二轮PCR扩增仅进行3个循环，即三个变性、退火、延伸循环。在一些实施方案中，第一引物和/或第二引物的量适合进行所述循环数。在一些实施方案中，本专利技术的方法中一个变性、退火、延伸循环中可以包括一次或多次退火，例如1，2，3，4，5次退火。已经发现第一轮PCR扩增和/或第二轮PCR扩增能够通过仅进行3个循环(优选在1个循环中进行多次退火)构建高质量BRCA1/2基因的扩增子文库。在一些实施方案中，本专利技术构建的BRCA1/2基因的扩增子文库的测序深度分布更加均匀。在一些实施方案中，变性、退火、延伸循环的温度可以根据采用的第一和/或第二引物适当的选择。在一些实施方案中，本专利技术的方法中第一轮PCR扩增和/或第二轮PCR扩增的退火温度没有特别限制，例如可以采用55℃-70℃之间的任何退火温度，例如55℃，56℃，57℃，58℃，59℃，60℃，61℃，62℃，63℃，64℃，65℃，66℃，67℃，68℃，69℃，70℃或任何之间的温度。在一些实施方案中，本专利技术的方法中第一轮PCR扩增和/或第二轮PCR扩增的退火时间没有特别限制，例如可以退火30-180秒，例如30秒，45秒，60秒，75秒，90秒，105秒，120秒，135秒，150秒，165秒，180秒或任何之间的时间。在一些实施方案中，所述退火包括在55℃-70℃之间的不同温度退火。在一些实施方案中，例如所述退火可以包括在57℃退火30秒，59℃退火30秒，61℃退火30秒和62℃退火30秒，其总退火时间在30-180秒之间。举例而言，所述退火可以包括在55℃退火15秒，56℃退火30秒，61℃退火45秒和62℃退火15秒，其总退火时间在30-180秒之间。在一些实施方案中，第一引物和/或第二引物的量适合将第一轮PCR扩增和/或第二轮PCR扩增进行小于10个循环，例如5个以下循环，例如进行5、4、3、2、1个循环。在一些实施方案中，本专利技术中的第一引物和第二引物可以分别为正向引物和反向引物，或反之，即第一引物和第二引物可以分别为反向引物和正向引物。在一些实施方案中，本专利技术的第一引物和第二引物包含靶向BRCAl/2基因的特异性序列。在一些实施方案中，如本领域技术人员已知的，可以向扩增产物添加接头或index序列。在一些实施方案中，本专利技术的第一引物和第二引物还可以包含接头和/或index序列。在一些实施方案中，接头或index序列可以在第三轮PCR扩增中添加。在一些实施方案中，本专利技术中的接头和/或index序列没有特别限制，本领域技术人员可以采用适当的序列作为接头和/或index序列。在一些实施方案中，本专利技术中的第一轮PCR、第二轮PCR和/或第三轮PCR包括纯化步骤和相应的纯化装置和/或试剂。对PCR扩增产物进行纯化的方法是本领域技术人员熟知的，例如可以通过磁珠进行所述纯化步骤。在一些实施方案中，本专利技术的第一轮PCR、第二轮PCR和/或第三轮PCR(包括纯化步骤)在一个容器中进行。如上所述，为了避免大量引物二聚体的生成，扩增子测序技术过程中通常需要将反应体系从一管拆分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于BRCA1/2基因的扩增子文库构建试剂盒，所述试剂盒包含：1)用于进行第一轮PCR扩增的第一引物，2)用于进行第二轮PCR扩增的第二引物，3)第三引物和第四引物，其用于以第二轮PCR扩增产物为模板进行第三轮PCR扩增，构建目的基因的扩增子文库，其中第一引物和第二引物为BRCA1/2基因的特异性引物，其中上述1)、2)和3)分别置于分开的容器中。

【技术特征摘要】
1.一种用于BRCA1/2基因的扩增子文库构建试剂盒，所述试剂盒包含：1)用于进行第一轮PCR扩增的第一引物，2)用于进行第二轮PCR扩增的第二引物，3)第三引物和第四引物，其用于以第二轮PCR扩增产物为模板进行第三轮PCR扩增，构建目的基因的扩增子文库，其中第一引物和第二引物为BRCA1/2基因的特异性引物，其中上述1)、2)和3)分别置于分开的容器中。2.权利要求1所述的试剂盒，其中第一引物和/或第二引物的量适合将第一轮PCR扩增和/或第二轮PCR扩增进行5个以下循环，例如进行5、4、3、2、1个循环。3.权利要求1-2任一项所述的试剂盒，其中第一引物和第二引物分别为正向引物和反向引物，或分别为反向引物和正向引物。4.权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其中第一引物和第二引物除包含靶向BRCA1/2基因的特异性序列外，还包含接头和/或index序列。5.权利要求1-4任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含以下一项或多项：4)纯化装置，例如磁珠，其用于第一轮PCR扩增、第二轮PCR扩增和/或第三轮PCR扩增产物的纯化，5)纯化试...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈俊，李夏静，陈才夫，李福根，许青，熊磊，
申请(专利权)人：上海思路迪生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31