一株浅黄霉素基因簇敲除的须糖多孢菌工程菌株及其应用制造技术

一株浅黄霉素基因簇敲除的须糖多孢菌工程菌株及其应用，所述浅黄霉素基因簇敲除的须糖多孢菌工程菌株也称为12号基因簇敲除菌（Saccharopolyspora pogona‑△cluster12），于2019年1月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019070。将本发明专利技术浅黄霉素基因簇敲除的须糖多孢菌工程菌株应用于丁烯基多杀菌素的生物合成，与利用原始菌株S.pogona进行丁烯基多杀菌素的生物合成相比，丁烯基多杀菌素的产量提高6倍以上。

An Engineering Strain of Polyspora tenuifolia Knocked out by Flavomycin Gene Cluster and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一株浅黄霉素基因簇敲除的须糖多孢菌工程菌株及其应用
本专利技术涉及一株浅黄霉素基因簇敲除的须糖多孢菌工程菌株及其应用。
技术介绍
使传统化学农药是当前控制农业病虫害的主要方法，但是，长期依赖和大量使用化学农药，对环境造成了严重的破坏，食品安全也无法得到保障。随着人们环保意识的增强和生活品质的提高，生物农药因其选择性强、不伤害天敌、无污染和不易产生抗性等优点，越来越受到人们的关注。丁烯基多杀菌素(butenyl-spinosyn)是由须糖多孢菌(Saccharopolysporapogona)产生的一类与多杀菌素结构类似的大环内酯类抗生素。到目前为止，丁烯基多杀菌素组分共检测到31种，这类化合物具有很好的防治农林害虫、卫生害虫和线虫的作用，是当今世界上最具发展前景的新型生物农药之一。然而，现有丁烯基多杀菌素产生菌的发酵产量低，生长周期长，限制了这一绿色生物农药的工业化生产和推广应用。因此，提高丁烯基多杀菌素产量对于农业害虫防治及生物安全具有重要的意义。2018年，Li等人首次通过基因工程技术完成对须糖多孢菌聚核苷酸磷酸激酶基因(pnp)研究，并获得高产突变株，使得利用基因工程技术对须糖多孢菌基因组进行定向遗传修饰成为提高丁烯基多杀菌素产量的有效方法（Impactonstraingrowthandbutenyl-spinosynbyoverexpressionofpolynucleotidephosphorylasegeneinSaccharopolysporapogona,LiL等，102（18）：8011-8021，2018）。但效果尚欠理想。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一株浅黄霉素基因簇敲除的须糖多孢菌工程菌株，旨在利用该浅黄霉素基因簇敲除的须糖多孢菌工程菌株进行丁烯基多杀菌素的生物合成，提高丁烯基多杀菌素生物合成的产量，降低丁烯基多杀菌素生产成本。本专利技术解决其技术问题采用的技术方案是，一株该浅黄霉素基因簇敲除的须糖多孢菌工程菌株，即12号基因簇敲除的工程菌株，也即须糖多孢菌S.pogona-△cluster12，Saccharopolysporapogona-△cluster12，于2019年1月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：中国武汉武昌区，武汉大学)，菌种保藏编号为CCTCCNO:M2019070。所述浅黄霉素基因簇，为须糖多孢菌基因组聚酮合成基因簇，其基因簇序列如序列表SEQID№.1所示。本专利技术之浅黄霉素基因簇敲除的须糖多孢菌工程菌株的构建方法如下：（1）提取须糖多孢菌NRRL30141基因组，分别扩增1Kb大小的浅黄霉素基因簇上下游同源臂；（2）将sgRNA与上下游同源臂进行融合，与质粒pKCcas9dO进行酶连，获得重组质粒pKCcas9-sgRNA-UHA-DHA;（3）接合转移构建工程菌株S.pogona-△cluster12及其PCR鉴定；（4）对构建的须糖多孢菌12号基因簇敲除工程菌（S.pogona-△cluster12）进行生理特性分析。比较蛋白质组学分析浅黄霉素基因簇敲除后对须糖多孢菌蛋白表达水平的影响。本专利技术在构建好重组质粒pKCcas9-sgRNA-UHA-DHA的基础上，利用原生质体转化的方法将外源重组质粒转入须糖多孢菌中，获得了浅黄霉素基因簇敲除的工程菌株S.pogona-△cluster12。PCR鉴定结果表明，外源质粒已成功导入须糖多孢菌中；生长曲线测定结果显示，本专利技术工程菌株S.pogona-△cluster12在培养6天后进入稳定期，相对于原始菌晚2天左右，培养至第10天后，本专利技术工程菌S.pogona-△cluster12菌体密度是原始菌株的76.3%左右；扫描电镜观察结果发现，本专利技术工程菌S.pogona-△cluster12在合成发酵培养基培养至第4天后菌丝体较长，菌丝体有结状凸起；利用比较蛋白质组技术对本专利技术工程菌S.pogona-△cluster12和原始菌株第6天全蛋白进行分析，发现浅黄霉素基因簇敲除能够引起至少803个基因差异表达，GO(GeneOntology)和KEGGpathway分析显示，这些差异表达的基因涉及糖酵解、三羧酸循环、脂肪酸代谢、氧化磷酸化等多个生物学过程。HPLC检测结果表明，利用本专利技术浅黄霉素基因簇敲除的须糖多孢菌工程菌株S.pogona-△cluster12进行丁烯基多杀菌素的生物合成，与利用原始菌株S.pogona进行丁烯基多杀菌素的生物合成相比，丁烯基多杀菌素的产量提高6.36倍。微生物保藏情况说明本专利技术之须糖多孢菌浅黄霉素基因簇敲除工程菌，（12号基因簇敲除工程菌株），即S.pogona-△cluster12，Saccharopolysporapogona-△cluster12，于2019年2月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，(简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学)，保藏号为CCTCCNO:M2019070。附图说明图1原始菌浅黄霉素基因簇核心基因的qRT-PCR分析；图2重组质粒pKCcas9d-sgRNA-UHA-DHA的构建流程图；图3本专利技术工程菌株S.pogona-△cluster12PCR鉴定图；图4本专利技术工程菌株S.pogona-△cluster12生长曲线测定及葡萄糖消耗分析；图5本专利技术工程菌株S.pogona-△cluster12菌丝形态图；图6本专利技术工程菌株S.pogona-△cluster12丁烯基多杀菌素产量分析及质谱鉴定；图7本专利技术工程菌株S.pogona-△cluster12蛋白表达差异及功能分析；图8本专利技术工程菌株S.pogona-△cluster12差异表达蛋白调控网络分析。具体实施方式以下结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步详细说明。（一）具体培养基配方和培养条件（1）S.pogona种子活化培养基CSM(Completesyntheticmedium)：TrypticSoyBroth4.5g/L，Glucose0.9g/L，Yeastextract0.3g/L，MgSO4.7H2O0.22g/L。接种单克隆或2%菌种保藏液加入装有20mLCSM的150mL摇瓶中，30°C，200r/min培养48h;（2）S.pogona合成发酵培养基SFM(Syntheticfermentationmedium)：Glucose20.0g/L，Yeastextract4.0g/L，Tryptone4.0g/L，KNO31.0g/L，K2HPO4·3H2O0.5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，FeSO4·7H2O0.01g/L。接种2%的菌种活化液加入装有50mLSFM的300mL摇瓶中，30°C，250r/min培养12d。（3）原生质体转化采用R5培养基：蔗糖103g/L，葡萄糖10g/L，酪蛋白氨基酸0.1g/L，Yeastextract5g/L，K2SO40.25g/L，MgCl2·6H2O10.12g/L，TES5.73g/L，微量元素溶液2ml(ZnCl240mg/L，FeCl3·6H2O200mg/L,CuCl2·2H2O10mg/L,MnCl2·4H2O10mg/L,Na2B4O7·10H2O本文档来自技高网...

【技术保护点】
1. 一株浅黄霉素基因簇敲除的须糖多孢菌工程菌株，其特征在于：为须糖多孢菌12号基因簇敲除工程菌（

【技术特征摘要】
1.一株浅黄霉素基因簇敲除的须糖多孢菌工程菌株，其特征在于：为须糖多孢菌12号基因簇敲除工程菌（S.pogona-△cluster12），于2019年1月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2019070。2.根据权利要求1所述的浅黄霉素基因簇敲除的须糖多孢菌工程菌株，其特征在于：利用CRISPR/Cas9技术，构建重组质粒pKC...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏立秋，何昊城，穰杰，丁学知，
申请(专利权)人：湖南师范大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43