本发明专利技术涉及一种低溶氧条件下高产有机酸的黑曲霉(Aspergillus niger)基因工程菌株，所述基因工程菌株的构建步骤如下：步骤1，构建异源表达vhb基因质粒；所述基因vhb序列片段由黑曲霉3‑磷酸甘油脱氢酶基因启动子PgpdA控制；步骤2，异源表达vhb基因菌株的获得，即得低溶氧条件下高产有机酸的黑曲霉(Aspergillus niger)基因工程菌株。本发明专利技术基于黑曲霉产生有机酸的天然特性，通过遗传重组改造黑曲霉的生理特性，获得了一种黑曲霉基因工程菌株，经过实验证实，该黑曲霉基因工程菌株在低溶氧情况下生产有机酸的能力显著提升，为微生物发酵法制备有机酸提供了优良菌种。
A Genetically Engineered Aspergillus Niger Strain with High Organic Acids Production under Low Dissolved Oxygen Conditions and Its Application
【技术实现步骤摘要】
一种低溶氧条件下高产有机酸的黑曲霉基因工程菌株及应用
本专利技术属于基因工程
，尤其是一种耐低溶氧条件高产有机酸的黑曲霉(Aspergillusniger)基因工程菌株及应用。
技术介绍
黑曲霉作为重要的细胞工厂用于有机酸的发酵生产已有100多年的历史，不仅是GRAS(generallyregardedsafe)菌株，而且能够利用廉价的碳源。柠檬酸和L-苹果酸是当前在食品、医药等行业最为重要的两种有机酸。在所有有机酸的市场中，柠檬酸市场占有率70％以上，可用作调味剂，也可用作食用油的抗氧化剂。同时改善食品的感官性状，增强食欲和促进体内钙、磷物质的消化吸收。在医药行业，柠檬酸主要被用于输血或化验室血样抗凝时，用作体外抗凝药。由于L-苹果酸味道柔和、酸度大，且不损害口腔牙齿、不积累脂肪，成为一种低热量的国际食品界公认的安全性食品酸味剂，是目前世界食品行业中用量最大和发展前景较好的有机酸之一。在医药行业，L-苹果酸被用于治疗肝病、贫血、尿毒症等多种疾病。而且由于L-苹果酸在代谢上利于氨基酸的吸收，常被配入复合氨基酸注射液中。因此，国际市场上对L-苹果酸的需求量与日俱增。透明颤菌血红蛋白(Vitreoscillahemoglobin，VHb)，是透明颤菌在低氧环境中产生的一种可溶性蛋白，能够高效的吸附氧。由于透明颤菌是一种专性好氧的革兰氏阴性丝状菌，最早在河底沉积物以及牛粪中分离得到，当其处于这种缺氧环境中时，就会合成可溶性的血红蛋白VHb，机制有利于其适应低氧环境。Holmberg等首次将VHb蛋白基因vgb导入烟草细胞中，VHb基因大大提高了植物的氧代谢，使得烟草的生长发育变快，发芽开花的时间也提前了，并且烟叶中叶绿素液和尼古丁的含量也得到了提高。DeModena等发现产黄青霉菌在常规氧气条件下，头孢菌素C的总合成率显著降低，氧源供应减少会导致头孢菌素C前体青霉素N的积累，于是通过将VHb基因整合到产黄青霉菌中，通过提高氧气通量，提高内部氧气浓度，从而提高头孢菌素C的产量。在地中海拟分枝酸菌中，当培养到固定阶段时，地中好拟分枝酸菌黏度增高，大大降低溶氧水平，而此时开始二级代谢，需要更大的溶氧量，于是将vgb导入到地中海拟分枝酸菌中，可以更有效地吸收氧气，从而可以提高利福霉素的产量。在历年报道中，VHb基因的作用只在于提高氧传递能力，暂未有研究指出别的功能作用。当前，黑曲霉发酵生产有机酸需要高转速及高通气量来维持足够溶氧，而低溶氧的情况对发酵产酸造成不可逆转的破坏。因此，构建一种异源表达vhb基因的黑曲霉基因工程菌株，能够有效解决发酵过程因低溶氧造成的破坏问题。通过检索，尚未发现与本专利技术专利申请相关的专利公开文献。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种耐低溶氧条件高产有机酸的黑曲霉(Aspergillusniger)基因工程菌株及应用，本专利技术基于黑曲霉产生有机酸的天然特性，通过遗传重组改造黑曲霉的生理特性，获得了一种黑曲霉基因工程菌株，经过实验证实，该黑曲霉基因工程菌株在低溶氧情况下生产有机酸的能力显著提升，为微生物发酵法制备有机酸提供了优良菌种。本专利技术解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：一种耐低溶氧条件高产有机酸的黑曲霉(Aspergillusniger)基因工程菌株，所述基因工程菌株的构建步骤如下：步骤1，构建异源表达vhb基因质粒：首先由北京华大基因公司合成经过密码子优化的vhb基因序列片段，所述基因vhb序列片段的核苷酸序列为SEQNO.1，长度为456bp。然后将该片段经过EcoRI和KpnI双酶切回收克隆到载体pLH454，构建基因vhb异源表达质粒pLH577；所述基因vhb序列片段由黑曲霉3-磷酸甘油脱氢酶基因启动子PgpdA控制，所述启动子PgpdA序列为SEQNO.2，长度为932bp；步骤2，异源表达vhb基因菌株的获得：将所述质粒pLH577转化至黑曲霉宿主菌株，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组获得异源表达vhb基因菌株S743，即得低溶氧条件下高产有机酸的黑曲霉(Aspergillusniger)基因工程菌株。而且，所述载体pLH454的构建步骤如下：分别以黑曲霉和构巢曲霉基因组为模板，经PCR扩增黑曲霉3-磷酸甘油脱氢酶基因启动子PgpdA和构巢曲霉色氨酸合成基因C终止子Ttrpc序列片段，将所述启动子、终止子序列片段克隆到载体pLH419，构建基因表达质粒pLH454；所述启动子PgpdA序列为SEQNO.2，长度为932bp；所述终止子Ttrpc序列为SEQNO.3，长度为719bp。而且，所述载体pLH419的构建步骤如下：以pLH331质粒为模板，以包含多克隆位点序列的P1055、P1056为引物进行PCR扩增loxP-hph-loxP片段，然后将该片段经XhoI和HindIII双酶切后和经相同双酶切处理得到的不包含loxP-hph-loxP序列的pLH331质粒线性化片段用T4DNA酶连接，连接产物经转化于大肠杆菌JM109感受态细胞，最终得到质粒pLH419。而且，所述黑曲霉宿主菌株为出发菌株S575。如上所述的耐低溶氧条件高产有机酸的黑曲霉(Aspergillusniger)基因工程菌株在制备有机酸方面中的应用。利用如上所述的黑曲霉(Aspergillusniger)基因工程菌株发酵产生苹果酸的方法，具体步骤如下：首先，将黑曲霉(Aspergillusniger)基因工程菌株接种在PDA培养平板上，在28℃培养6天直至产生分生孢子；然后，将孢子粉接种至含有发酵培养基的250mL容量的摇瓶中，孢子的终浓度为2×106孢子/mL，在28℃，200rpm发酵7天，即得苹果酸；其中，所述发酵培养基的组成为：100g/L葡萄糖,80g/LCaCO3,6g/L蛋白胨,150mg/LKH2PO4,150mg/LK2HPO4,100mg/LMgSO·7H2O,100mg/LCaCl2·2H2O,5mg/LFeSO4·7H2O,5mg/LNaCl。如上所述的低溶氧条件下高产有机酸的黑曲霉(Aspergillusniger)基因工程菌株在制备柠檬酸方面中的应用。利用如上所述的黑曲霉(Aspergillusniger)基因工程菌株发酵产生柠檬酸的方法，具体步骤如下：首先，将菌株接种在PDA培养平板上，在28℃培养6天直至产生分生孢子；然后，将孢子粉接种至含有发酵培养基的250mL容量的摇瓶中，孢子的终浓度为2×106孢子/mL，在28℃，200rpm发酵7天，即得柠檬酸；其中，所述发酵培养基的组成为：100g/L蔗糖,2.5g/LNH4NO3,1g/LMgSO·7H2O,1g/LKH2PO4,500mg/L酵母提取物。本专利技术取得的优点和积极效果是：1、本专利技术基于黑曲霉产生有机酸的天然特性，通过遗传重组改造黑曲霉的生理特性，获得了一种黑曲霉基因工程菌株，经过实验证实，该黑曲霉基因工程菌株在低溶氧情况下生产有机酸的能力显著提升，为微生物发酵法制备有机酸提供了优良菌种。经过7天低溶氧摇瓶发酵，可将100g/L的葡萄糖转化成115g/LL-苹果酸，苹果酸对葡萄糖的转化率达到1.54mol/mol。经过3天低溶氧摇瓶发酵，柠檬酸的产量可达到11.4g/L。本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种耐低溶氧条件高产有机酸的黑曲霉(Aspergillus niger)基因工程菌株，其特征在于：所述基因工程菌株的构建步骤如下：步骤1，构建异源表达vhb基因质粒：首先由北京华大基因公司合成经过密码子优化的vhb基因序列片段，所述基因vhb序列片段的核苷酸序列为SEQ NO.1，长度为456bp。然后将该片段经过EcoR I和Kpn I双酶切回收克隆到载体pLH454，构建基因vhb异源表达质粒pLH577；所述基因vhb序列片段由黑曲霉3‑磷酸甘油脱氢酶基因启动子PgpdA控制，所述启动子PgpdA序列为SEQ NO.2，长度为932bp；步骤2，异源表达vhb基因菌株的获得：将所述质粒pLH577转化至黑曲霉宿主菌株，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组获得异源表达vhb基因菌株S743，即得低溶氧条件下高产有机酸的黑曲霉(Aspergillus niger)基因工程菌株。
【技术特征摘要】
1.一种耐低溶氧条件高产有机酸的黑曲霉(Aspergillusniger)基因工程菌株，其特征在于：所述基因工程菌株的构建步骤如下：步骤1，构建异源表达vhb基因质粒：首先由北京华大基因公司合成经过密码子优化的vhb基因序列片段，所述基因vhb序列片段的核苷酸序列为SEQNO.1，长度为456bp。然后将该片段经过EcoRI和KpnI双酶切回收克隆到载体pLH454，构建基因vhb异源表达质粒pLH577；所述基因vhb序列片段由黑曲霉3-磷酸甘油脱氢酶基因启动子PgpdA控制，所述启动子PgpdA序列为SEQNO.2，长度为932bp；步骤2，异源表达vhb基因菌株的获得：将所述质粒pLH577转化至黑曲霉宿主菌株，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组获得异源表达vhb基因菌株S743，即得低溶氧条件下高产有机酸的黑曲霉(Aspergillusniger)基因工程菌株。2.根据权利要求1所述的耐低溶氧条件高产有机酸的黑曲霉(Aspergillusniger)基因工程菌株，其特征在于：所述载体pLH454的构建步骤如下：分别以黑曲霉和构巢曲霉基因组为模板，经PCR扩增黑曲霉3-磷酸甘油脱氢酶基因启动子PgpdA和构巢曲霉色氨酸合成基因C终止子Ttrpc序列片段，将所述启动子、终止子序列片段克隆到载体pLH419，构建基因表达质粒pLH454；所述启动子PgpdA序列为SEQNO.2，长度为932bp；所述终止子Ttrpc序列为SEQNO.3，长度为719bp。3.根据权利要求2所述的耐低溶氧条件高产有机酸的黑曲霉(Aspergillusniger)基因工程菌株，其特征在于：所述载体pLH419的构建步骤如下：以pLH331质粒为模板，以包含多克隆位点序列的P1055、P1056为引物进行PCR扩增loxP-hph-loxP片段，然后将该片段经XhoI和HindIII双酶切后和经相同双酶切处理得到的不包含loxP-hph-loxP序列的pLH331质粒线性化片段用...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘浩，周宇涛，黄和，徐永学，徐晴，曹威，
申请(专利权)人：天津科技大学，南京师范大学，
类型：发明
国别省市：天津,12
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