一种氧化石墨烯亲和固定化载体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种氧化石墨烯亲和固定化载体及其制备方法与应用，该亲和载体的制备包括氧化石墨烯的羧化、氧化石墨烯羧基的活化、聚乙二醇氨的修饰、螯合配基的修饰以及Ni

An affinity immobilization carrier of graphene oxide and its preparation method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种氧化石墨烯亲和固定化载体及其制备方法与应用
本专利技术涉及纳米材料固定化酶，属于纳米复合材料领域，具体是一种氧化石墨烯亲和固定化载体及其制备方法与应用。
技术介绍
补充
技术介绍
酶是一类具有催化功能的生物分子，它在食品、医药以及工业生产中均有广泛应用。酶的特点包括高效性、专一性、反应条件温和。但是游离酶环境敏感性强，难以重复利用且不利于后续产物的分离，在工业化生产中存在诸多问题。为了解决这一难题，固定化酶技术应运而生。它是将水溶性酶通过选用不同的固定方法以及固定载体，变为不溶于水但仍具有催化活性的一种生物技术。固定化酶较游离酶有很多优点，如稳定性高、可进行工艺加工、可重复使用以及利于后续分离。固定化酶技术从20世纪60年代发展至今，已成为生物技术中最热门的研究领域。传统的固定化酶方法包括吸附、共价结合、包埋以及交联。但是，这些方法存在许多不足之处。吸附法容易造成酶的解吸附；共价结合容易破坏酶的结构；造成酶活回收率的大幅度损失；包埋容易造成底物的传质受限；交联反应较为激烈，酶活力损失较大。酶固定化的新趋势是在“活化的”支持物和蛋白质表面上存在的特定基团之间产生不同的(生物)亲和键，这种相互作用发生在生物体的几乎所有重要生物过程中，如抗体和抗原、生物素和亲和素、金属离子和组氨酸标签等。亲和固定化提供了若干优点，包括：(1)与所有生物分子相似的选择性和定向固定，因为“结合位点或支持物的特定基团”具有相同的连接，(2)酶结构中诱导的构象变化的最小化，和(3)用酶重新加载相同的活化表面并根据不同的需求重新使用载体的可能性。通过特定的亲和力相互作用固定酶有两个主要要求：(1)生物相容性载体的选择，该载体应具有必需的官能团(具有非常高的亲和力)并且能够特异性识别目标蛋白质外表面上存在的靶基团或者可以容易地官能化(2)酶表面上特定基团的可用性。因此，生物相容性载体的选择至关重要。在大多数情况下，一些载体如无机氧化物、矿物质等不能满足酶亲和的要求，很少应用于亲和固定化。相比之下，生物聚合物如壳聚糖以及琼脂糖通常具有高蛋白质亲和力以及生物相容性，可用作亲和固定化的载体。随着亲和固定化酶的实际应用可能性的不断增长，一些新型的载体如二氧化硅、磁性纳米粒子、碳纳米管、复合材料以及氧化石墨烯也广泛用于亲和固定化。氧化石墨烯由于其独特的优势如高比表面积、良好的热稳定性和化学稳定性、易于官能化和表面易调控等已被用作不同生物技术应用中酶固定的基质。Hermanová等人将脂肪酶固定在氧化石墨烯上，固定化酶具有高活性以及高稳定性；Su等人通过戊二醛将碱性蛋白酶共价结合到氧化石墨烯上，与游离酶相比，固定化蛋白酶的热稳定性和可重复使用性得到了明显改善；Zhou等人以多巴胺修饰氧化石墨烯用于葡萄糖氧化酶的固定化，实验结果表明，固定化酶热稳定性和pH稳定性均得到显着提高。然而氧化石墨烯作为固定化载体常常导致酶结构和功能的显着损失，如辣根过氧化物酶(HRP)和酯酶与氧化石墨烯结合后损失约70％的活性，酶活性的显著丧失可能与疏水性以及静电性有关。这也使得以氧化石墨烯作为亲和固定化载体的报道相对较少。聚乙二醇氨是一种人工合成的高分子材料，具有柔顺、亲水、良好的生物相容性以及对酶结构惰性等特点。在固定化过程中，其可通过其链结构的柔顺性来延长酶蛋白与载体分子作用时间而减少其反冲力，维持酶的正确构象。载体经聚乙二醇氨修饰后，由原先刚性以及疏水性质变为柔顺以及亲水性质，减少酶与载体之间的碰撞作用，维持酶分子的正常构象，同时，聚乙二醇氨的修饰使酶与载体之间的距离较远，从而使酶具有较高的自由度，有利于酶与底物之间的亲和。综上所述，以聚乙二醇氨功能化氧化石墨烯以用作亲和固定化的载体是可行的方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：解决氧化石墨烯对酶结构及其功能的影响，保持固定化酶的高活性以及高酶活回收率。为了解决上述技术问题，本专利技术采取的技术方案如下：一种氧化石墨烯亲和固定化载体的制备方法，包括如下步骤：(1)氧化石墨烯的羧化：将氧化石墨烯超声分散于N,N-二甲基甲酰胺中，制成浓度为0.5～5mg/mL的氧化石墨烯悬浊液，然后加入马来酸酐混合均匀，将混合物于70～90℃下反应1～3h，经离心，洗涤，冻干，即得羧化的氧化石墨烯；(2)氧化石墨烯的表面活化：将步骤(1)羧化的氧化石墨烯按照浓度0.5～1mg/mL超声分散于纯水中，加入2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液制成浓度为0.125～0.25mg/mL的羧化的氧化石墨烯悬浊液，然后依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐活化反应15～30min，再加入N-羟基琥珀酰亚胺活化反应1～3h，活化时的反应温度为4～25℃；经离心，洗涤，重悬，制成浓度为0.5～1mg/mL表面活化的氧化石墨烯悬浊液；(3)氧化石墨烯表面的氨基修饰：在步骤(2)浓度为0.5～1mg/mL表面活化的氧化石墨烯悬浊液中加入聚乙二醇氨，控制pH在7.0～7.5之间，在25～30℃下反应6～12h，经离心，洗涤，重悬，制成浓度为0.5～1mg/mL表面氨基修饰的氧化石墨烯悬浊液；(4)氧化石墨烯表面的亲和离子修饰：在步骤(3)浓度为0.5～1mg/mL表面氨基修饰的氧化石墨烯悬浊液中加入1～4wt％的戊二醛水溶液，控制pH在7.8～8.2之间，在25～30℃下反应2～5h，离心，洗涤，重悬，得到浓度为0.5～1mg/mL表面氨基活化的氧化石墨烯悬浊液；向上述浓度为0.5～1mg/mL表面氨基活化的氧化石墨烯悬浊液中加入金属离子螯合剂，控制pH在7.8～8.2之间，在25～30℃下反应6～12h，离心，洗涤，重悬，得到浓度为0.5～1mg/mL表面修饰螯合配基的氧化石墨烯悬浊液；再向上述浓度为0.5～1mg/mL表面修饰螯合配基的氧化石墨烯悬浊液中加入NiCl2`6H2O溶液，控制pH在7.8～8.2之间，在25～30℃下反应2～4h，经离心，洗涤后，即得。具体地，步骤(1)中，所述的马来酸酐按照质量体积比15～300mg/mL加入浓度为0.5～5mg/mL的氧化石墨烯悬浊液中。氧化石墨烯经马来酸酐羧化的目的获得更多羧基修饰的位点。步骤(2)中，所述的2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液pH为6～6.5，浓度为0.05～0.15moL/L。所述的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐按照质量体积比0.25～0.75mg/mL加入浓度为0.125～0.25mg/mL羧化的氧化石墨烯悬浊液中。与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐反应的目的是活化羧基，使羧基与其生成活性酯。所述的N-羟基琥珀酰亚胺按照质量体积比0.125～3.125mg/mL加入浓度为0.125～0.25mg/mL羧化的氧化石墨烯悬浊液中。与N-羟基琥珀酰亚胺反应的目的是稳定生成的活性酯，抑制其水解。氧化石墨烯的表面活化的目的是使羧基与聚乙二醇氨的氨基反应。步骤(3)中，所述的聚乙二醇氨按照质量体积比1.5～3mg/mL加入浓度为0.5～1mg/mL表面活化的氧化石墨烯悬浊液中。氧化石墨烯表面的氨基修饰的作用是功能化氧化石墨烯以改善其结构和性质。步骤(4)中，所述的戊二醛水溶液按照体积比0.5～1:1加入到0.5～1mg/mL表面氨基修饰的氧本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种氧化石墨烯亲和固定化载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)氧化石墨烯的羧化：将氧化石墨烯超声分散于N,N‑二甲基甲酰胺中，制成浓度为0.5～5mg/mL的氧化石墨烯悬浊液，然后加入马来酸酐混合均匀，将混合物于70～90℃下反应1～3h，经离心，洗涤，冻干，即得羧化的氧化石墨烯；(2)氧化石墨烯的表面活化：将步骤(1)羧化的氧化石墨烯按照浓度0.5～1mg/mL超声分散于纯水中，加入2‑(N‑吗啉代)乙磺酸缓冲液制成浓度为0.125～0.25mg/mL的羧化的氧化石墨烯悬浊液，然后依次加入1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐活化反应15～30min，再加入N‑羟基琥珀酰亚胺活化反应1～3h，活化时的反应温度为4～25℃；经离心，洗涤，重悬，制成浓度为0.5～1mg/mL表面活化的氧化石墨烯悬浊液；(3)氧化石墨烯表面的氨基修饰：在步骤(2)浓度为0.5～1mg/mL表面活化的氧化石墨烯悬浊液中加入聚乙二醇氨，控制pH在7.0～7.5之间，在25～30℃下反应6～12h，经离心，洗涤，重悬，制成浓度为0.5～1mg/mL表面氨基修饰的氧化石墨烯悬浊液；(4)氧化石墨烯表面的亲和离子修饰：在步骤(3)浓度为0.5～1mg/mL表面氨基修饰的氧化石墨烯悬浊液中加入1～4wt％的戊二醛水溶液，控制pH在7.8～8.2之间，在25～30℃下反应2～5h，离心，洗涤，重悬，得到浓度为0.5～1mg/mL的表面氨基活化的氧化石墨烯悬浊液；向上述浓度为0.5～1mg/mL的表面氨基活化的氧化石墨烯悬浊液中加入金属离子螯合剂，控制pH在7.8～8.2之间，在25～30℃下反应6～12h，离心，洗涤，重悬，得到浓度为0.5～1mg/mL表面修饰螯合配基的氧化石墨烯悬浊液；再向上述浓度为0.5～1mg/mL表面修饰螯合配基的氧化石墨烯悬浊液中加入NiCl2`6H2O溶液，控制pH在7.8～8.2之间，在25～30℃下反应2～4h，经离心，洗涤后，即得。...

【技术特征摘要】
1.一种氧化石墨烯亲和固定化载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)氧化石墨烯的羧化：将氧化石墨烯超声分散于N,N-二甲基甲酰胺中，制成浓度为0.5～5mg/mL的氧化石墨烯悬浊液，然后加入马来酸酐混合均匀，将混合物于70～90℃下反应1～3h，经离心，洗涤，冻干，即得羧化的氧化石墨烯；(2)氧化石墨烯的表面活化：将步骤(1)羧化的氧化石墨烯按照浓度0.5～1mg/mL超声分散于纯水中，加入2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液制成浓度为0.125～0.25mg/mL的羧化的氧化石墨烯悬浊液，然后依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐活化反应15～30min，再加入N-羟基琥珀酰亚胺活化反应1～3h，活化时的反应温度为4～25℃；经离心，洗涤，重悬，制成浓度为0.5～1mg/mL表面活化的氧化石墨烯悬浊液；(3)氧化石墨烯表面的氨基修饰：在步骤(2)浓度为0.5～1mg/mL表面活化的氧化石墨烯悬浊液中加入聚乙二醇氨，控制pH在7.0～7.5之间，在25～30℃下反应6～12h，经离心，洗涤，重悬，制成浓度为0.5～1mg/mL表面氨基修饰的氧化石墨烯悬浊液；(4)氧化石墨烯表面的亲和离子修饰：在步骤(3)浓度为0.5～1mg/mL表面氨基修饰的氧化石墨烯悬浊液中加入1～4wt％的戊二醛水溶液，控制pH在7.8～8.2之间，在25～30℃下反应2～5h，离心，洗涤，重悬，得到浓度为0.5～1mg/mL的表面氨基活化的氧化石墨烯悬浊液；向上述浓度为0.5～1mg/mL的表面氨基活化的氧化石墨烯悬浊液中加入金属离子螯合剂，控制pH在7.8～8.2之间，在25～30℃下反应6～12h，离心，洗涤，重悬，得到浓度为0.5～1mg/mL表面修饰螯合配基的氧化石墨烯悬浊液；再向上述浓度为0.5～1mg/mL表面修饰螯合配基的氧化石墨烯悬浊液中加入NiCl2`6H2O溶液，控制pH在7.8～8.2之间，在25～30℃下反应2～4h，经离心，洗涤后，即得。2.根据权利要求1所述的氧化石墨烯亲和固定...

【专利技术属性】
技术研发人员：应汉杰，庄伟，朱倩倩，周文凤，吴菁岚，朱晨杰，杨朋朋，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32