用于改善的免疫细胞疗法的靶向基因插入制造技术

本发明专利技术涉及适应性细胞免疫疗法领域。其提供外源编码序列的遗传插入，这协助免疫细胞引导其针对感染或恶性细胞的免疫应答。这些外源编码序列更特别地在对免疫细胞活化敏感的内源基因启动子的转录控制下被插入。该方法使得产生具有更高治疗潜力的更安全的免疫原代细胞。

Targeted gene insertion for improved immunocytotherapy

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于改善的免疫细胞疗法的靶向基因插入
本专利技术涉及适应性细胞免疫疗法领域。其旨在增强原代免疫细胞针对发展免疫抗性的病症(如肿瘤)的功能，从而改善这些免疫细胞的治疗潜力。本专利技术的方法提供外源编码序列的遗传插入，这帮助免疫细胞引导它们针对感染或恶性细胞的免疫应答。这些外源编码序列更特别地在内源基因启动子或对免疫细胞活化不敏感的启动子的转录控制下插入，所述内源基因启动子在免疫细胞活化时、在肿瘤微环境或危及生命的炎症条件下上调或下调。本专利技术还提供了序列特异性核酸内切酶试剂和供体DNA载体(例如AAV载体)，以在所述特定基因座处进行这种靶向插入。本专利技术的方法有助于改善工程化的原代免疫细胞的治疗潜力和安全性，以便有效地用于细胞疗法中。
技术介绍
十多年来，通过针对一系列病症(特别是HIV感染和白血病)的许多临床试验，已经建立了包括造血细胞谱系在内的原代免疫细胞群的有效临床应用(TristenS.J.etal.(2011)TreatingcancerwithgeneticallyengineeredTcells.TrendsinBiotechnology.29(11):550-557)。然而，这些临床试验的大多数都使用了从患者本身或从相容的供体获得的免疫细胞，主要是NK和T细胞，这对可用免疫细胞的数量、它们的适应性以及它们克服已经制定了绕过或减少患者免疫系统的策略的疾病的效率带来了一些限制。作为获得同种异体免疫细胞的主要进展，已通过基因编辑产生了作为“现成的”治疗产品可获得的通用免疫细胞(Poirotetal.(2015)MultiplexGenome-EditedT-cellManufacturingPlatformfor“Off-the-Shelf”AdoptiveT-cellImmunotherapiesCancerRes.75:3853-64)。这些通用免疫细胞通过将特异性稀切核酸内切酶表达到源自供体的免疫细胞中可获得，具有通过双链断裂破坏它们的自我识别遗传决定簇的作用。自从世纪之交出现的第一个可编程序列特异性试剂(最初称为Meganuclease)以来(Smithetal.(2006)Acombinatorialapproachtocreateartificialhomingendonucleasescleavingchosensequences.Nucl.AcidsRes.34(22):e149.)，已经开发了不同类型的序列特异性核酸内切酶试剂，其提供了改善的特异性、安全性和可靠性。TALE-核酸酶(WO2011072246)，它们是TALE结合结构域与切割催化结构域的融合体，已成功应用于原代免疫细胞，特别是来自外周血单核细胞(PBMC)的T细胞。以名称上市的此种TALE-核酸酶是目前用于同时灭活源自供体的T细胞中的基因序列的那些，其特别地用于生产其中破坏了编码TCR(T细胞受体)和CD52的基因的同种异体治疗性T细胞。这些细胞可赋予有嵌合抗原受体(CAR)以治疗癌症患者(US2013/0315884)。TALE-核酸酶是非常特异的试剂，因为它们需要在强制异二聚体形式下通过成对来结合DNA，以获得切割结构域Fok-1的二聚化。左和右异二聚体成员各自识别约14至20bp的不同核酸序列，共同跨越30至50bp整体特异性的靶序列。已经基于细菌化脓性链球菌的II型原核CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列(ClusteredRegularlyInterspacedShortpalindromicRepeats))适应性免疫系统的组分开发了其它核酸内切酶试剂。这种多组分系统称为RNA引导的核酸酶系统(Gasiunas,Barrangouetal.2012；Jinek,Chylinskietal.2012)，涉及与引导RNA分子偶联的Cas9或Cpf1核酸内切酶家族的成员，所述引导RNA分子具有将所述核酸酶驱动到某些特定的基因组序列的能力(Zetscheetal.(2015).Cpf1isasingleRNA-guidedendonucleasethatprovidesimmunityinbacteriaandcanbeadaptedforgenomeeditinginmammaliancells.Cell163:759-771)。这种可编程的RNA引导的核酸内切酶易于产生，因为切割特异性由所述RNA引导的序列决定，这可以容易地设计并且廉价地生产。CRISPR/Cas9的特异性虽然依靠比大约10pb的TAL-核酸酶短的序列，但其必须位于靶向基因序列中的特定基序(PAM)附近。已经使用DNA单链寡核苷酸(DNA引导)与Argonaute蛋白质组合描述了类似的系统(Gao,F.etal.DNA-guidedgenomeeditingusingtheNatronobacteriumgregoryiArgonaute(2016)doi:10.1038/nbt.3547)。到目前为止，还证明了源自归巢核酸内切酶的其它核酸内切酶系统(来自：I-OnuI或I-CreI)在与或不与TAL-核酸酶(来自：MegaTAL)或者锌-指核酸酶组合的情况下的特异性，但程度较小。同时，通过转基因T细胞受体或所谓的嵌合抗原受体(CAR)的遗传转移，可以赋予免疫细胞新的特异性(Jenaetal.(2010)RedirectingT-cellspecificitybyintroducingatumor-specificchimericantigenreceptor.Blood.116:1035-1044)。CAR是重组受体，其在单个融合分子中包含与一个或多个信号传导结构域相关联的靶向部分。通常，CAR的结合部分由单链抗体(scFv)的抗原结合结构域组成，包含通过柔性接头连接的单克隆抗体的轻和重可变片段。基于受体或配体结构域的结合部分也已成功使用。第一代CAR的信号传导结构域来自CD3zeta的细胞质区域或Fc受体γ链。已证明第一代CAR成功地重定向T细胞的细胞毒性，然而它们未能在体内提供延长的扩增和抗肿瘤活性。来自共刺激分子(包括CD28、OX-40(CD134)、ICOS和4-1BB(CD137)的信号结构域已单独添加(第二代)或组合添加(第三代)，以增强CAR修饰T细胞的存活率并增加其增殖。CAR已经成功地使得T细胞重定向针对在来自各种恶性肿瘤(包括淋巴瘤和实体瘤)的肿瘤细胞表面表达的抗原。使用TALE-核酸酶破坏T细胞受体(TCR)的最新工程T细胞，其被赋予有靶向CD19恶性抗原的嵌合抗原受体(CAR)，所述工程T细胞称为“UCART19”产物，已在至少两个患有难治性白血病的婴儿中显示出治疗潜力(Leukaemiasuccessheraldswaveofgene-editingtherapies(2015)Nature527:146–147)。为了获得这样的UCART19细胞，在加帽的mRNA电穿孔后将TALE-核酸酶瞬时表达到细胞中以操作TCR基因破坏，而使用逆转录病毒载体将编码嵌合抗原受体(CARCD19)的盒随机引入基因组中。在后一种的方法中，基因失活和表达嵌合抗原受体的步骤在诱导T细胞“离体”活化后独立地进行。然本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于制备用于细胞免疫疗法的工程化原代免疫细胞的方法，所述方法包括：‑提供原代免疫细胞的群；‑向所述原代免疫细胞的一部分中引入：i)至少一种核酸，包含要整合在选定内源基因座上的外源核苷酸或多核苷酸序列，以编码改善所述免疫细胞的群的治疗潜力的至少一种分子；ii)特异性靶向所述选定内源基因座的至少一种序列特异性试剂，其中通过靶向的基因整合将所述外源核苷酸或多核苷酸序列插入所述内源基因座，使得所述外源核苷酸或多核苷酸序列形成受存在于所述基因座处的内源启动子的转录控制的外源编码序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.10.27 DK PA201670840;2016.10.19 US 62/410,1871.用于制备用于细胞免疫疗法的工程化原代免疫细胞的方法，所述方法包括：-提供原代免疫细胞的群；-向所述原代免疫细胞的一部分中引入：i)至少一种核酸，包含要整合在选定内源基因座上的外源核苷酸或多核苷酸序列，以编码改善所述免疫细胞的群的治疗潜力的至少一种分子；ii)特异性靶向所述选定内源基因座的至少一种序列特异性试剂，其中通过靶向的基因整合将所述外源核苷酸或多核苷酸序列插入所述内源基因座，使得所述外源核苷酸或多核苷酸序列形成受存在于所述基因座处的内源启动子的转录控制的外源编码序列。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述序列特异性试剂是核酸酶。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中通过同源重组或NHEJ至所述免疫细胞内操作所述靶向的基因整合。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中选择所述内源启动子以在免疫细胞活化期间具有活性。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中由所述外源编码序列编码的所述分子是RNA转录物如RNAi，或多肽如功能蛋白。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中改善所述原代免疫细胞的群的治疗潜在活性的所述分子赋予所述免疫细胞抗药性，增加所述免疫细胞的持久性(体内或体外)或其安全性。7.根据权利要求6所述的方法，其中增强所述原代免疫细胞的持久性的所述分子选自细胞因子受体、赋予抗药性的蛋白质或者针对抑制性肽或蛋白质的分泌型抗体。8.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述外源编码序列编码IL-2、IL-12或IL-15。9.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中赋予抗药性的所述外源编码序列编码二氢叶酸还原酶(DHFR)、肌苷单磷酸脱氢酶2(IMPDH2)、钙调磷酸酶或甲基鸟嘌呤转移酶(MGMT)、mTORmut和Lckmut。10.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述外源序列编码趋化因子或细胞因子，例如IL-2、IL-12和IL-15。11.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中增强治疗活性的所述外源序列编码FOXP3的抑制剂。12.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中增强T细胞的治疗活性的所述外源序列编码肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的分泌性抑制剂，例如CCR2/CCL2中和剂。13.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中增强所述原代免疫细胞的安全性的所述外源序列编码嵌合抗原受体(CAR)的组分。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述CAR是有助于所述免疫细胞针对特定细胞类型的改善特异性的抑制性CAR。15.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中增强所述原代免疫细胞的安全性的所述外源序列编码具有直接杀死所述细胞、与其它化合物组合杀死所述细胞或通过活化其它化合物杀死所述细胞的能力的因子。16.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中增强所述原代免疫细胞的安全性的所述外源序列编码细胞凋亡CAR的组分。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述细胞凋亡CAR包含FasL(CD95)。18.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中增强所述原代免疫细胞的安全性的所述外源序列编码细胞色素P450、CYP2D6-1、CYP2D6-2、CYP2C9、CYP3A4、CYP2C19或CYP1A2，赋予所述免疫细胞对药物如环磷酰胺和/或异磷酰胺的敏感性。19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述基因处于在免疫细胞活化期间持续具有活性的内源启动子的转录控制下。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述基因选自CD3G、Rn28s1、Rn18s、Rn7sk、Actg1、β2m、Rpl18a、Pabpc1、Gapdh、Rpl17、Rpl19、Rplp0、Cfl1和Pfn1。21.根据权利要求19所述的方法，其中所述内源启动子的转录活性是稳定的并且不依赖于免疫细胞活化。22.根据权利要求21所述的方法，其中处于稳定且不依赖于免疫细胞活化的所述内源启动子的控制下的所述基因是CD3。23.根据权利要求22所述的方法，其中引入到所述基因中的所述序列编码TCR结合结构域，任选地与多肽CD3、CD28或4-1BB融合。24.根据权利要求21所述的方法，其中在活性稳定且不依赖于免疫细胞活化的所述内源启动子的控制下引入到所述基因中的所述编码序列编码细胞因子、趋化因子受体、赋予产物抗性的分子、共刺激配体如4-1BRL和OX40L、或分泌性抗体。25.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述内源启动子的转录活性依赖于免疫细胞活化。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述内源启动子的所述转录活性在免疫细胞活化时是短暂的。27.根据权利要求25所述的方法，其中所述内源启动子的所述转录活性被上调。28.根据权利要求27所述的方法，其中所述转录活性被强烈上调。29.根据权利要求28所述的方法，其中引入到转录活性被强烈上调的所述基因中的所述外源序列更特别地编码细胞因子、免疫原性肽或分泌性抗体如抗IDO1抗体、抗IL10抗体、抗PD1抗体、抗PDL1抗体、抗IL6抗体或抗PGE2抗体。30.根据权利要求27所述的方法，其中所述转录活性被弱上调。31.根据权利要求30所述的方法，其中引入到转录活性是短暂的或弱上调的所述基因中的所述序列更特别地编码抑制性CAR或细胞凋亡CAR的成分，以改善所述免疫细胞的安全性的特异性。32.根据权利要求26所述的方法，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：布莱恩·布瑟尔，菲利普·杜沙托，亚历山大·朱利拉特，洛朗·普瓦罗，朱利安·瓦尔顿，
申请(专利权)人：塞勒克提斯公司，
类型：发明
国别省市：法国,FR