一种渔用浸泡免疫复合佐剂及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种低毒、高效、速效、长效的渔用浸泡免疫复合佐剂及其制备方法与应用，涉及水产养殖。所述渔用浸泡免疫复合佐剂，由以下质量百分比组分制成：RH‑40 25～35％、无水乙醇10～20％、黄芪多糖10～15％、蜂胶5～8％、乙酸乙酯3～6％、抗坏血酸钠1～3％、氯化钠1～2％和蒸馏水11～55％。

A Immersion Immune Complex Adjuvant for Fisheries and Its Preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种渔用浸泡免疫复合佐剂及其制备方法与应用
本专利技术涉及水产养殖，尤其是一种渔用浸泡免疫复合佐剂及其制备方法与应用。
技术介绍
无污染的渔用疫苗因其可安全、有效地预防水产养殖动物疫病，已成为国际上水产疫病防控的主流技术，渔用疫苗的研发向着“高效、实用、低价、多样”方向发展，浸泡口服、多联多价、区域差异化免疫方案等实用性技术将应用到生产管理。其中浸泡免疫操作简单、可短时间内实现批量注射、对鱼体刺激小，对鱼种鱼苗接种效果更佳，且浸泡免疫具有激发鱼体黏膜免疫应答的潜力，对于防御由黏膜组织进入鱼体的病原有重要意义，推广价值高。目前水产养殖生产上应用的疫苗大多为灭活疫苗，接种后不能在动物体内繁殖，接种剂量大，保护周期短。而浸泡免疫过程中疫苗用量大，而鱼体获得的免疫力却相对较弱，免疫成本高，严重制约了浸泡免疫的生产推广应用。因此在不断构建新的鱼用疫苗基础上，研究如何提高浸泡免疫效果的意义重大。鱼用疫苗免疫效果的优劣与佐剂的选择、使用方法存在较大的关系。浸泡免疫在小规格、大批量处理方面具有明显的优越性，通过佐剂和新操作技术的使用可以显著提高疫苗的免疫保护率，因此佐剂与疫苗使用的研究与开发已成为鱼类免疫学领域的热点，随着新材料新技术的应用，越来越多的佐剂和技术将进入浸泡免疫，提高浸泡免疫效果。但目前来看，浸泡免疫中抗原递呈，特别是对抗原的大小、性质、敏感与耐受等方面还缺乏科学性系统性的数据支撑，因此，对浸泡佐剂和操作技术的筛选缺乏切实的针对性，制约了产业发展。通过多来源、多途径的方式开发低毒、高效、速效、长效的鱼用免疫佐剂，和安全、快捷、易操作的疫苗使用技术已成为鱼病防治，特别是重大疫病防控研究的发展趋势。
技术实现思路
本专利技术的目的之一为提供一种低毒、高效、速效、长效的渔用浸泡免疫复合佐剂。为实现上述目的，本专利技术提供的技术方案是：一种渔用浸泡免疫复合佐剂，由以下质量百分比组分制成：RH-4025～35％、无水乙醇10～20％、黄芪多糖10～15％、蜂胶5～8％、乙酸乙酯3～6％、抗坏血酸钠1～3％、氯化钠1～2％和蒸馏水11～55％。优选地，所述渔用浸泡免疫复合佐剂由以下质量百分比组分制成：RH-4030％、无水乙醇15％、黄芪多糖12％、蜂胶6％、乙酸乙酯5％、抗坏血酸钠2.5％、氯化钠1.5％和蒸馏水25.5％。本专利技术的目的之二在于提供上述渔用浸泡免疫复合佐剂的制备方法。为实现上述目的，本专利技术的提供的技术方案是：将蜂胶完全溶于无水乙醇中，并加入RH-40和乙酸乙酯，混匀后逐滴加入含量为37.5％(质量比)黄芪多糖水溶液，抗坏血酸和氯化钠，即得均匀透明的免疫复合佐剂。本专利技术的目的之三在于提供上述渔用浸泡免疫复合佐剂的应用。为实现上述目的，本专利技术提供的技术方案是：将免疫组在1.5％盐水中充气浸泡5min后，将免疫复合佐剂与疫苗按体积比1:1～2混合，置于水中按等量混合后的体积1.5-2％的浓度使用，浓度和剂量随鱼体规格变大而增加，见表1。表1疫苗使用浓度与鱼体规格对应表在批量免疫过程中要密切观察安全免疫测定鱼的稳定状态，如出现异常，应及时对对应的批量受免鱼在密度、水质等方面采取早期安全防护处理。通常选择在天气晴朗，水温适宜的上午8-10点，下午4-6点进行。鱼种吊养2—3小时后再开始浸泡操作。浸泡时间根据不同品种敏感性应事先进行试验。在苗种浸泡前一天，随机抽样20-50尾进行试验，在疫苗产品说明书规定的使用浓度、鱼种数量和充氧条件下，观察在规定的浸泡时间内是否出现异常反应，通过延长浸泡时间或提高疫苗使用浓度50％～100％或加大20％～50％鱼苗密度等做法，确定免疫操作在相应条件下对本批鱼苗是否安全。本品也可作为注射用佐剂，与疫苗使用的剂量为1:1-2，视疫苗颗粒大小而定，颗粒越大，使用佐剂的剂量越高。使用过程中，对溶氧敏感的鱼类，如鳜、笋壳鱼等，慎用。在浸泡第一次7天后二次浸泡效果更佳。本专利技术与现有的佐剂相比，具有以下优点：鱼类对抗原吸收能力弱，本专利技术所述的复合佐剂改变疫苗颗粒的在水体中的分布，稳定性好，在运输和储存过程中不会出现分层和沉淀；特别是对蜂胶佐剂的使用，可以最大程度上提高蜂胶的给药量，保护疫苗抗原。本专利技术所述的复合佐剂安全性高，改变鱼类皮肤表面黏膜特性，促进抗原吸收，还能降低鱼类因浸泡等操作引起的应激反应，解决了苗种规模化免疫的国际难题，可降低疫苗成本50％以上，为疫苗在低值鱼类中的产业化应用提供了可行性。本专利技术所述的复合佐剂可直接与疫苗使用，黏度低，不需要乳化，简化生产工艺，降低操作成本。本专利技术所述的复合佐剂可以促进浸泡免疫的应用，降低水产养殖动物发病，减少抗生素等药物的使用，加强了食品卫生安全保障。具体实施方式下面结合具体实施方式说明本专利技术：但是可以理解这些具体的实施方式只是用于说明本专利技术，而不是对本专利技术的限制。本领域的技术人员完全可以在本专利技术的启示下，对本专利技术的的具体实施方式或者技术特征进行改进，但这些经过改进或替换的技术技术方案，仍属于本专利技术的保护范围。实施例1本实施例的操作地点为：济宁市水产良种繁育场。(1)将养殖草鱼分为3组，每组300尾，受免鱼在含有本专利技术佐剂的嗜水气单胞菌灭活疫苗溶液中充氧浸泡15min，对照鱼仅在1.5％盐水浸泡5min。浸泡体积为50L，且浸泡疫苗混合溶液中细菌终浓度不小于4.2×108CFU/mL。(2)网箱试验中，复合佐剂与嗜水气单胞菌灭活疫苗一次浸泡免疫草鱼，2周血清抗体效价达到160，6周达到峰值640，8周为320，12周降低为40。结果显示，复合佐剂免疫组免疫时间越长，血清抗体效价也越高，在6周达到最高值，且复合佐剂浸泡免疫组一次浸泡免疫8周(约2个月)均有较高的血清抗体效价。(3)养殖6个月后出塘。草鱼养殖期间，长势良好，没有出现病害问题，在养殖过程中，没有因为出现水色不佳、氨氮、亚硝酸盐超标、PH值居高不下或者变化剧烈等原因，而发生嗜水气单胞菌感染。实施例2本实施例的操作地点为：广东省水产疫苗工程技术中心。(1)将鲫鱼分为8组，每组120尾。免疫组在1.5％盐水中充气浸泡5min后，分别在含2％的疫苗佐剂(疫苗和本专利技术佐剂体积比1:1)复合溶液中充气浸泡15min。首次免疫7d后同法进行加强免疫，对照组仅在1.5％盐水中浸泡5min。免疫后每组鱼随机分成4个平行组，放置在室内玻璃缸中充气饲养。每组浸泡体积为5L，浸泡疫苗溶液中细菌抗原浓度为4.6×108CFU/mL。(2)二次浸泡后20天，对改试验的鲫鱼使用嗜水气单胞菌SDLL2株进行攻毒实验。每组取实验鱼合计20尾，注射健康的草鱼，每尾注射0.2毫升，每组20尾，试验期间水温恒定在28℃左右，逐日观察试验鱼的发病情况，连续观察15日。要正确评估试验结果，每试验组至少需用10尾草鱼，本试验每个试验组均使用20尾草鱼，可以认为该试验是有效的。(3)二次浸泡免疫显示，复合佐剂使受免鱼相对保护率达到66.7％-88.0％，均显著高于无佐剂组的50.5-60.2％。实施例3本实施例的操作地点为：山东济宁市鱼台县鹿洼鱼苗场。(1)在鳙鱼、鲢鱼运苗车，运输两万尾，体长平均3cm，约600斤，水温22℃，分为两个水箱，每个箱体加水300L，水深3米，水面到水箱盖1米，以容纳增加氧气。在运输过程中使用氧气瓶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种渔用浸泡免疫复合佐剂，其特征在于，由以下质量百分比组分制成：RH‑40 25～35％、无水乙醇10～20％、黄芪多糖10～15％、蜂胶5～8％、乙酸乙酯3～6％、抗坏血酸钠1～3％、氯化钠1～2％和蒸馏水11～55％。

【技术特征摘要】
1.一种渔用浸泡免疫复合佐剂，其特征在于，由以下质量百分比组分制成：RH-4025～35％、无水乙醇10～20％、黄芪多糖10～15％、蜂胶5～8％、乙酸乙酯3～6％、抗坏血酸钠1～3％、氯化钠1～2％和蒸馏水11～55％。2.根据权利要求1所述的渔用浸泡免疫复合佐剂，其特征在于，由以下质量百分比组分制成：RH-4030％、无水乙醇15％、黄芪多糖12％、蜂胶6％、乙酸乙酯5％、抗坏血酸钠2.5％、氯化钠1.5％和蒸馏水25....

【专利技术属性】
技术研发人员：巩华，孙承文，赖迎迢，江小燕，陈总会，陶家发，黄志斌，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院珠江水产研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44