【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】NGS文库浓度的标准化相关申请交叉引用本申请要求2016年9月6日提交的美国临时专利申请号62/384,118的优先权，其通过引用全文纳入本文。
技术介绍
为了使高质量下一代测序(NGS)数据最大化，至关重要的是给测序仪器加载数量准确的文库DNA。文库DNA装载数量不足会导致簇密度低(Illumina)/模板阳性ISP低(IonTorrent)并且降低测序输出，而文库DNA过剩会导致嵌合簇(Illumina)/多克隆ISP(IonTorrent)并导致低量低质量数据。当汇集文库用于并行测序时，不准确的定量会导致测序数据不平衡，其中非足量文库被过度测序，而过量文库则测序不足。出于这些原因，可测序文库分子数量的准确定量在NGS工作流程是至关重要的一步。当汇集文库以产生用于杂交捕获的并行集合时，同样需要准确的文库定量。当前用于文库定量的方法包括芯片电泳(例如，安捷伦生物分析仪(AgilentBioanalyzer)，dsDNA的荧光测定方法(例如，Qubit)和qPCR(各种市售可得的试剂盒)。芯片电泳和荧光测定方法两者都仅能准确定量PCR扩增的、对全部加了衔接子的文库分子进行了富集的文库，因为这些方法不能区分无PCR文库制备物中的功能性分子(包含两个NGS衔接子的片段)和非功能性分子(仅包含1种或没有NGS衔接子的片段)。qPCR在NGS工作流程中被广泛地使用，因为其能够准确定量功能性文库分子，但是该方案涉及多次移液步骤并且花费大量的时间。各文库必需经连续稀释，qPCR试验按照标准曲线一式三份运行，然后进行qPCR数据分析。qPCR定量过程接近2个小时，包括至少45...
【技术保护点】
1.一种由起始量获得目标量经加工核酸分子用于后续测序试验的方法，其包括：提供含有所述起始量的经加工核酸分子的样品，其中所述起始量大于所述目标量；向所述样品添加连接酶和探针以产生第一反应混合物，其中所述探针的加量等于所述目标量；和在足以允许所述探针与部分所述经加工核酸分子连接的条件下孵育所述第一反应混合物，其中连接探针的那部分经加工核酸分子即所述目标量的经加工核酸分子。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.09.06 US 62/384,1181.一种由起始量获得目标量经加工核酸分子用于后续测序试验的方法，其包括：提供含有所述起始量的经加工核酸分子的样品，其中所述起始量大于所述目标量；向所述样品添加连接酶和探针以产生第一反应混合物，其中所述探针的加量等于所述目标量；和在足以允许所述探针与部分所述经加工核酸分子连接的条件下孵育所述第一反应混合物，其中连接探针的那部分经加工核酸分子即所述目标量的经加工核酸分子。2.如权利要求1所述的方法，在提供包含所述起始量的经加工核酸分子的样品之前，还包括提供包含以下内容的PCR混合物：(i)多个至少部分双链的核酸分子，所述至少部分双链的核酸分子各自含有第一链和第二链，(ii)含有第一部分的第一引物，所述第一部分与所述多个核酸分子中各核酸分子的所述第一链的靶标部分在序列上互补，(iii)第二引物，所述第二引物含有与所述多个核酸分子中各核酸分子所述第二链的靶标部分在序列上互补的序列，(iv)脱氧核苷酸，和(v)DNA聚合酶；在足以使DNA聚合酶延伸所述第一引物和所述第二引物的条件下孵育所述PCR混合物，从而产生所述经加工核酸分子；和纯化所述PCR混合物以去除未使用的第一引物和第二引物，从而产生含有所述起始量的经加工核酸分子的样品。3.如权利要求2所述的方法，其中，所述DNA聚合酶是具有3'外切核酸酶活性的热稳定DNA聚合酶，其产生钝端化的PCR产物。4.如权利要求2所述的方法，其中，所述DNA聚合酶是具有3'腺苷酰化活性的热稳定DNA聚合酶，其产生具有单碱基突出端的PCR产物。5.如权利要求2所述的方法，其中，所述第一引物包含第一部分、第二部分和第三部分，所述第一部分位于所述引物3'端并与所述多个核酸分子中各核酸分子所述第一链的靶标部分在序列上互补，所述第二部分位于所述第一部分5'侧并包含3个或更多个连续核糖核苷酸碱基，所述第三部分位于所述第二部分5'侧并包含两个或更多个脱氧核苷酸，其中所述DNA聚合酶具有3'外切核酸酶校对活性，并且在孵育所述PCR混合物后产生的所述经加工核酸分子各自包含5'突出端，所述5'突出端含有所述第一引物的所述第三部分和所述3个或更多个连续核糖核苷酸碱基中的至少一个。6.如权利要求5所述的方法，其中，所述3个或更多个连续核糖核苷酸碱基包含rU或rA碱基。7.如权利要求5所述的方法，其中，所述DNA聚合酶是DNA聚合酶Q5。8.如权利要求5所述的方法，其中，所述DNA聚合酶是GXLDNA聚合酶。9.如权利要求2所述的方法，其中所述第一引物包含第一部分、第二部分和第三部分，所述第一部分位于所述引物3'端并与所述多个核酸分子中各核酸分子所述第一链的靶标部分在序列上互补，所述第二部分位于所述第一部分5'侧并包含缓冲序列，所述第三部分位于所述第二部分5'侧并包含尾序列，所述尾序列由不同于所述缓冲序列中核苷酸的核苷酸组成，并且所述第二引物包含第四部分和第五部分，所述第四部分位于所述引物3'端并与所述多个核酸分子中各核酸分子所述第二链的靶标部分在序列上互补，所述第五部分位于所述第四部分5'侧并包含具有与缓冲序列相同核苷酸组成的序列。10.如权利要求9所述的方法，在纯化所述PCR混合物以去除未使用的第一引物和第二引物后，还包括向包含所述起始量的经加工核酸分子的样品添加T4DNA聚合酶和脱氧核苷酸，所述脱氧核苷酸与所述缓冲序列的核苷酸互补但不与所述尾序列的核苷酸互补；在足以允许所述T4DNA聚合酶3'外切核酸酶活性修剪所述尾序列并在所述缓冲序列的位置产生5'突出端的条件下，孵育包含所述起始量的经加工核酸分子、T4DNA聚合酶和脱氧核苷酸的样品，所述脱氧核苷酸与所述缓冲序列的核苷酸互补但不与所述尾序列的核苷酸互补，其中所述T4DNA聚合酶因其聚合酶活性和所述互补脱氧核苷酸的存在阻止3'外切核酸酶的消化超过所述缓冲序列。11.如权利要求10所述的方法，其中，所述孵育所述第一反应混合物的步骤与孵育包含起始量的经加工核酸分子、T4DNA聚合酶和脱氧核苷酸的样品同时进行，所述脱氧核苷酸与所述缓冲序列的核苷酸互补但不与所述尾序列的核苷酸互补，从而允许在经加工核酸分子上生成5'突出端以及所述探针与所述经加工核酸分子连接。12.如权利要求11所述的方法，其中，所述探针包含由与所述缓冲序列相同的脱氧核苷酸组成的3'端缓冲序列，从而赋予所述探针抵抗所述T4DNA聚合酶3'外切核酸酶活性的抗性。13.如权利要求9所述的方法，其中，所述缓冲序列包括均聚物，二核苷酸或三核苷酸重复序列。14.如权利要求9所述的方法，其中，所述第二引物的第五部分和所述缓冲序列为5至10个碱基长。15.如权利要求9所述的方法，其中，所述尾序列为10至20个碱基长。16.如权利要求2所述的方法，孵育所述PCR混合物后，还包括向包含所述起始量的经加工核酸分子的所述样品添加核酸酶；和在足以使所述核酸酶切割所述经加工核酸分子的碱基以产生3'突出端的条件下孵育所述核酸酶和包含所述起始量的经加工核酸分子的所述样品，其中所述第一引物还包含可切割的碱基。17.如权利要求16所述的方法，其中，所述可切割的碱基选自脱氧尿苷，核糖核苷酸，肌苷及其组合，并且所述核酸酶选自尿嘧啶DNA糖基化酶，RNA酶和内切核酸酶V。18.如权利要求2所述的方法，孵育所述PCR混合物后，还包括向包含所述起始量的经加工核酸分子的所述样品添加5'外切核酸酶；和在足以消化部分各经加工核酸分子以产生3'突出端的条件下孵育所述5'外切核酸酶和包含所述起始量的经加工核酸分子的所述样品，其中所述第一引物还包含5'外切核酸酶抗性修饰。19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中，所述经加工核酸分子是下一代测序(NGS)文库。20.如权利要求19所述的方法，其中，各所述经加工核酸分子包含位于所述分子第一末端的第一衔接子序列和位于与所述第一末端相对的第二末端的第二衔接子序列，并且所述第一衔接子序列和所述第二衔接子序列相同或不同。21.如权利要求20所述的方法，其中，所述第一衔接子序列是第一下一代测序衔接子，并且所述第二衔接子是第二下一代测序衔接子。22.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中，所述探针包含修饰，所述修饰赋予抵抗被具有外切核酸酶活性的酶消化的抗性。23.如权利要求22所述的方法，其中，所述赋予抵抗被具有外切核酸酶活性的酶消化的抗性的修饰包括三个或更多个连续的硫代磷酸酯连接。24.如权利要求22所述的方法，孵育所述第一反应混合物后，还包括向所述第一反应混合物添加具有外切核酸酶活性的酶以产生第二反应混合物；和在足以允许消化未连接到所述探针的经加工核酸分子的条件下孵育所述第二反应混合物，从而分离所选目标量的经加工核酸分子。25.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中，所述经加工核酸分子包含缺失部分完整NGS衔接子序列的非功能性下一代测序(NGS)衔接子，并且所述探针包含如下所述的多核苷酸序列：所述多核苷酸序列包含NGS衔接子具有功能所需的那部分NGS衔接子序列。26.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，与所述经加工核酸分子的探针连接是钝端连接，其中所述经加工核酸分子各自包含钝端，并且所述探针包含与所述经加工核酸分子各自的钝端相容的钝端。27.如权利要求1-2和5-15中任一项所述的方法，其中，经加工核酸分子各自包含5'突出端，并且，与所述经加工核酸分子的探针连接是粘性末端连接。28.如权利要求1-2和16-18中任一项所述的方法，其中，经加工核酸分子各自包含3'突出端，并且，与所述经加工核酸分子的探针连接是粘性末端连接。29.如权利要求1-2和5-18中任一项所述的方法，其中，经加工核酸分子各自包含低复杂性序列，并且所述探针包含与所述低复杂性序列互补的序列从而相比复杂核苷酸序列的杂交速率提高低探针浓度时所述探针与所述经加工核酸分子的杂交速率。30.如权利要求29所述的方法，其中，所述低复杂性序列包括选自下述的序列：多聚(A)，多聚(T)，多聚(G)，多聚(C)，多聚(AG)，多聚(AC)，多聚(GT)，多聚(CT)，多聚(AT)，多聚(GC)，三核苷酸，四核苷酸和五核苷酸，并且所述低复杂性核苷酸序列位于所述突出端的末端位置。31.如权利要求30所述的方法，其中，所述低复杂性序列位于所述经加工核酸分子内部或所述经加工核酸分子的末端。32.如权利要求1-18中任一项所述的方法，所述探针是单链或双链多核苷酸。33.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中，所述纯化PCR混合物以去除未使用的第一引物和第二引物的步骤通过固相可逆固定化进行。34.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中，所述连接酶选自：T4DNA连接酶，T3DNA连接酶，T7DNA连接酶，大肠杆菌DNA连接酶，Taq连接酶，扩增酶，9°N连接酶和PfuDNA连接酶。35.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中，所述探针包含单链DNA。36.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中，所述探针包含单链DNA并且形成发夹结构。37.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中，所述探针包含至少部分双链的DNA。38.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中，所述探针包含5'磷酸，3'羟基或5'磷酸和3'羟基两者。39.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述探针在3'末端还包含C3间隔区或3'磷酸。40.如权利要求1-2和5-15中任一项所述的方法，其中，经加工核酸分子各自包含5'突出端，并且所述5'突出端包含8-50个碱基。41.如权利要求1-2和16-18中任一项所述的方法，其中，经加工核酸分子各自包含3'突出端，并且所述3'突出端包含8-50个碱基。42.如权利要求1-2和5-15中任一项所述的方法，其中，经加工核酸分子各自包含5'突出端，并且所述探针的至少部分与所述5'突出端的至少部分互补。43.如权利要求1-2和16-18中任一项所述的方法，其中，经加工核酸分子各自包含3'突出端，并且所述探针的至少部分与所述3'突出端的至少部分互补。44.一种由起始量非功能性NGS文库获得目标量功能性NGS文库用于后续测序试验的方法，其包括：提供包含起始量非功能性NGS文库的样品，所述非功能性NGS文库包含核酸文库分子，各核酸文库分子至少部分双链并且包含截短的NGS衔接子序列，所述截短的NGS衔接子序列缺少所述NGS衔接子具有功能所需的部分所述完整NGS衔接子序列；向所述样品添加连接酶和探针以产生第一反应混合物，其中所述探针的加量等于所述目标量，并且所述探针包含如下所述的多核苷酸序列：所述多核苷酸序列包含NGS衔接子具有功能所需的那部分NGS衔接子序列；在足以允许所述探针与部分所述非功能性NGS文库连接的条件下孵育所述第一反应混合物，其中与所述探针连接的所述非功能性NGS文库部分即所述目标量，从而产生所述目标量的功能性NGS库。45.如权利要求44所述的方法，在提供包含所述起始量的经加工核酸分子的样品之前，还包括提供包含以下内容的PCR混合物：(i)多个至少部分双链的核酸分子，所述至少部分双链的核酸分子各自含有第一链和第二链，(ii)含有第一部分的第一引物，所述第一部分与所述多个核酸分子中各核酸分子所述第一链的靶标部分在序列上互补，(iii)第二引物，所述第二引物含有与所述多个核酸分子中各核酸分子所述第二链的靶标部分在序列上互补的序列，(iv)脱氧核苷酸，和(v)DNA聚合酶；在足以使DNA聚合酶延伸所述第一引物和所述第二引物的条件下孵育所述PCR混合物，从而产生所述非功能性NGS文库；和纯化所述PCR混合物以去除未使用的第一引物和第二引物，从而产生含有所述起始量非功能性NGS文库的样品，其中所述第一引物包含所述截短的NGS衔接子序列，其缺少NGS衔接子具有功能所需的部分完整NGS衔接子序列。46.如权利要求45所述的方法，其中，所述DNA聚合酶是具有3'外切核酸酶活性的热稳定DNA聚合酶，其产生钝端化的PCR产物。47.如权利要求45所述的方法，其中，所述DNA聚合酶是具有3'腺苷酰化活性的热稳定DNA聚合酶，其产生具有单碱基钝端的PCR产物。48.如权利要求45所述的方法，其中，所述第一引物包含第一部分、第二部分和第三部分，所述第一部分位于所述引物3'端并与所述多个核酸分子中各核酸分子所述第一链的靶标部分在序列上互补，所述第二部分位于所述第一部分5'侧并包含3个或更多个连续核糖核苷酸碱基，所述第三部分位于所述第二部分5'侧并且包含两个或更多个脱氧核苷酸，其中所述DNA聚合酶具有3'外切核酸酶校对活性，并且，孵育所述PCR混合物后产生的所述经加工核酸分子各自包含5'突出端，所述5'突出端含有所述第一引物的所述第三部分和所述3个或更多个连续核糖核苷酸碱基中的至少一个。49.如权利要求48所述的方法，其中，所述3个或更多个连续核糖核苷酸碱基包含rU或rA碱基。50.如权利要求48所述的方法，其中，所述DNA聚合酶是DNA聚合酶Q5。51.如权利要求48所述的方法，其中，所述DNA聚合酶是GXLDNA聚合酶。52.如权利要求45所述的方法，其中所述第一引物包含第一部分、第二部分和第三部分，所述第一部分位于所述引物3'端并与所述多个核酸分子中各核酸分子所述第一链的靶标部分在序列上互补，所述第二部分位于所述第一部分5'侧并包含缓冲序列，所述第三部分位于所述第二部分5'侧并包含尾序列，所述尾序列由不同于所述缓冲序列中核苷酸的核苷酸组成，并且，所述第二引物包含第四部分和第五部分，所述第四部分位于所述引物3'端并与所述多个核酸分子中各核酸分子所述第二链的靶标部分在序列上互补，所述第五部分位于所述第四部分5'侧并且包含具有与缓冲序列相同核苷酸组成的序列。53.如权利要求52所述的方法，在纯化所述PCR混合物以去除未使用的第一引物和第二引物后，还包括向包含所述起始量的经加工核酸分子的样品添加T4DNA聚合酶和脱氧核苷酸，所述脱氧核苷酸与所述缓冲序列的核苷酸互补但不与所述尾序列的核苷酸互补；和在足以允许所述T4DNA聚合酶3'外切核酸酶活性修剪所述尾序列并在所述缓冲序列的位置产生5'突出端的条件下孵育包含所述起始量的经加工核酸分子、T4DNA聚合酶和脱氧核苷酸的样品，所述脱氧核苷酸与所述缓冲序列的核苷酸互补但不与所述尾序列的核苷酸互补，其中所述T4DNA聚合酶因其聚合酶活性和所述互补脱氧核苷酸的存在阻止3'外切核酸酶的消化超过所述缓冲序列。54.如权利要求53所述的方法，其中，所述孵育所述第一反应混合物的步骤与孵育包含起始量的经加工核酸分子、T4DNA聚合酶和脱氧核苷酸的样品同时进行，所述脱氧核苷酸与所述缓冲序列的核苷酸互补但不与所述尾序列的核苷酸互补，从而允许在经加工核酸分子上生成5'突出端以及所述探针与所述经加工核酸分子连接。55.如权利要求54所述的方法，其中，所述探针包含由与所述缓冲序列相同的脱氧核苷酸组成的3'端缓冲序列，从而赋予所述探针抵抗所述T4DNA聚合酶3'外切核酸酶活性的抗性。56.如权利要求52所述的方法，其中，所述缓冲序列包括均聚物，二核苷酸或三核苷酸重复序列。57.如权利要求52所述的方法，其中，所述第二引物的第五部分和所述缓冲序列为5至10个碱基长。58.如权利要求52所述的方法，其中，所述尾序列为10至20个碱基长。59.如权利要求45所述的方法，孵育所述PCR混合物后，还包括向所述PCR混合物添加核酸酶；和在足以使所述核酸酶切割所述经加工核酸分子的碱基以产生3'突出端的条件下孵育所述核酸酶和所述PCR混合物，其中所述第一引物还包含可切割的碱基。60.如权利要求59所述的方法，其中，所述可切割的碱基选自脱氧尿苷，核糖核苷酸，肌苷及其组合，并且所述核酸酶选自尿嘧啶DNA糖基化酶，RNA酶和内切核酸酶V。61.如权利要求45所述的方法，孵育所述PCR混合物后，还包括向所述PCR混合物添加5'外切核酸酶；和在足以部分消化各经加工核酸分子以产生3'突出端的条件下孵育所述5'外切核酸酶和所述PCR混合物，其中所述第一引物还包含5'外切核酸酶抗性修饰。62.如权利要求44-61中任一项所述的方法，其中，各核酸文库分子在与第二末端相对的第一末端处还包含完整NGS衔接子序列，其中所述截短的NGS衔接子序列位于所述第二末端。63.如权利要求44-61中任一项所述的方法，其中，所述探针包含修饰，所述修饰赋予抵抗被具有外切核酸酶活性酶的消化的抗性。64.如权利要求44-46中任一项所述的方法，其中，与所述经加工核酸分子的探针连接是钝端连接，其中所述经加工核酸分子各自包含钝端，并且所述探针包含与所述经加工核酸分子各自的钝端相容的钝端。65.如权利要求44-45和48-58中任一项所述的方法，其中，经加工核酸分子各自包含5'突出端，并且与所述经加工核酸分子的探针连接是粘性末端连接。66.如权利要求44-45和59-61中任一项所述的方法，其中，经加工核酸分子各自包含3'突出端，并且与所述经加工核酸分子的探针连接是粘性末端连接。67.如权利要求44-45和48-61中任一项所述的方法，其中，经加工核酸分子各自包含低复杂性序列，并且所述探针包含与所述低复杂性序列互补的序列从而相比复杂核苷酸序列的杂交速率提高低探针浓度时所述探针与所述经加工核酸分子的杂交速率。68.如权利要求67所述的方法，其中，所述低复杂性序列包括选自下述的序列：多聚(A)，多聚(T)，多聚(G)，多聚(C)，多聚(AG)，多聚(AC)，多聚(GT)，多聚(CT)，多聚(AT)，多聚(GC)，三核苷酸，四核苷酸和五核苷酸，并且所述低复杂性核苷酸序列位于所述突出端的末端位置。69.如权利要求68所述的方法，其中，所述低复杂性序列位于所述经加工核酸分子内部或所述经加工核酸分子的末端。70.如权利要求44-61中任一项所述的方法，所述探针是单链或双链多核苷酸。71.如权利要求44-61中任一项所述的方法，其中，所述纯化PCR混合物以去除未使用的第一引物和第二引物的步骤通过固相可逆固定化进行。72.如权利要求44-61中任一项所述的方法，其中，所述连接酶选自：T4DNA连接酶，T3DNA连接酶，T7DNA连接酶，大肠杆菌DNA连接酶，Taq连接酶，扩增酶，9°N连接酶和PfuDNA连接酶。73.如权利要求44-61中任一项所述的方法，其中，所述探针包含单链DNA。74.如权利要求44-61中任一项所述的方法，其中，所述探针包含单链DNA并且形成发夹结构。75.如权利要求44-61中任一项所述的方法，其中，所述探针包含至少部分双链的DNA。76.如权利要求44-61中任一项所述的方法，其中，探针包含5'磷酸，3'羟基或5'磷酸和3'羟基两者。77.如权利要求44-61中任一项所述的方法，其中所述探针在3'末端还包含C3间隔区或3'磷酸。78.如权利要求44-45和48-61中任一项所述的方法，其中，经加工核酸分子各自包含5'突出端，并且所述5'突出端包含8-50个碱基。79.如权利要求44-45和59-61中任一项所述的方法，其中，经加工核酸分子各自包含3'突出端，并且所述3'突出端包含8-50个碱基。80.如权利要求44-45和48-61中任一项所述的方法，其中，经加工核酸分子各自包含5'突出端，并且所述探针的至少部分与所述5'突出端的至少部分互补。81.如权利要求44-45和59-61中任一项所述的方法，其中，经加工核酸分子各自包含3'突出端，并且所述探针的至少部分与所述3'突出端的至少部分互补。82.一种由起始量非功能性NGS文库获得目标量功能性文库用于后续测序试验的方法，其包括：提供包含起始量非功能性NGS文库的样品，其中所述非功能性NGS文库包含核酸文库分子，各核酸文库分子至少部分双链并且包含截短的NGS衔接子序列，所述截短的NGS衔接子序列缺少所述NGS衔接子具有功能性所需的部分完整NGS衔接子序列，所述截短的NGS衔接子序列中3个或更多个连续碱基被相应的核糖核苷酸碱基取代，并且所述3个或更多个连续碱基不在所述截短的NGS衔接子序列的5'末端；向所述样品添加连接酶和探针以产生第一反应混合物，其中所述探针的加量等于所述目标量，并且所述探针包含如下所述的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包含NGS衔接子具有功能所需的那部分NGS衔接子序列；在足以允许所述探针与部分所述非功能性NGS文库连接的条件下孵育所述第一反应混合物，其中所述非功能性NGS文库中的那部分即所述目标量，从而产生所述目标量的功能性NGS库。83.如权利要求82所述的方法，其中，所述3个或更多个连续核糖核苷酸碱基包含rU或rA碱基。84.如权利要求82-84中任一项所述的方法，其中，所述核酸文库分子包含至少一个突出端，并且所述孵育所述第一反应混合物的步骤在足以允许所述探针至少部分退火结合所述突出端的条件下进行。85.如权利要求84所述的方法，其中，所述突出端是5'突出端。86.如权利要求84所述的方法，其中，所述突出端是3'突出端。87.如权利要求82所述的方法，其中，所述突出端还包含选自下述的低复杂性序列：多聚(A)，多聚(T)，多聚(G)，多聚(C)，多聚(AG)，多聚(AC)，多聚(GT)，多聚(CT)，多聚(AT)，多聚(GC)，三核苷酸，四核苷酸和五核苷酸，并且所述低复杂性核苷酸序列位于所述突出端的末端位置。88.如权利要求87所述的方法，其中，所述突出端是5'突出端。89.如权利要求87所述的方法，其中，所述突出端是3'突出端。90.如权利要求88所述的方法，其中，所述探针还包含与所述低复杂性核苷酸序列至少部分互补的序列，所述低复杂性核苷酸序列位于所述NGS衔接子功能性所需那部分NGS衔接子序列的3'。91.如权利要求90所述的方法，其中，所述探针包含位于所述NGS衔接子具有功能性所需那部分NGS衔接子序列3'的与所述低复杂性核苷酸序列互补的序列。92.如权利要求89所述的方法，其中，所述探针还包含与所述低复杂性核苷酸序列至少部分互补的序列，所述低复杂性核苷酸序列位于所述NGS衔接子序列功能所需那部分NGS衔接子序列的5'。93.如权利要求92所述的方法，其中，所述探针包含位于所述NGS衔接子具有功能性所需那部分NGS衔接子序列5'的与所述低复杂性核苷酸序列互补的序列。94.如权利要求87-93中任一项所述的方法，其中，所述低复杂性序列包含多聚(A)。95.如权利要求87-93中任一项所述的方法，其中，所述低复杂性序列包含多聚(T)。96.如权利要求84-95中任一项所述的方法，其中，所述突出端包含8-50个碱基。97.如权利要求82-96中任一项所述的方法，其中，所述连接酶选自下述：T4DNA连接酶，T3DNA连接酶，T7DNA连接酶，大肠杆菌DNA连接酶，Taq连接酶，扩增酶，9°N连接酶和PfuDNA连接酶。98.如权利要求82-97中任一项所述的方法，其中，所述探针包含单链DNA。99.如权利要求82-98中任一项所述的方法，其中，所述探针形成发夹结构。100.如权利要求82-97中任一项所述的方法，其中，所述探针包含具有突出端的双链DNA。101.如权利要求82-100中任一项所述的方法，其中所述探针包含5'磷酸，3'羟基或5'磷酸和3'羟基两者。102.如权利要求82-101中任一项所述的方法，其中所述探针在3'末端还包含C3间隔区或3'磷酸。103.如权利要求84-102中任一所述的方法，其中，所述探针长于所述核酸文库分子的突出端。104.一种由起始量获得目标量经加工核酸分子用于后续测序试验的方法，其包括：提供含有所述起始量的经加工核酸分子的样品，其中各所述经加工核酸分子是至少部分双链的，并且所述起始量大于所述目标量；向所述样品添加连接酶和探针以产生第一反应混合物，其中所述探针的加量等于所述目标量，并且所述探针包含充分互补从而与所述突出端序列至少部分杂交的多核苷酸序列，其中所述探针包括修饰，所述修饰赋予抵抗被具有外切核酸酶活性的酶消化的抗性；在足以允许所述探针退火结合所述突出端序列并允许所述探针与部分所述经加工核酸分子连接的条件下孵育所述第一反应混合物，其中连接探针的那部分经加工核酸分子即所述目标量的经加工核酸分子；在以所述探针和所述连接酶孵育所述反应复合物后，向所述第一反应混合物添加具有外切核酸酶活性的酶以产生第二反应混合物；在足以允许消化未连接到所述探针的经加工核酸分子的条件下孵育所述第二反应混合物，从而产生所述目标量的经加工核酸分子。105.如权利要求104所述的方法，在提供包含所述起始量的经加工核酸分子的样品之前，还包括提供包含以下内容的PCR混合物：(i)多个至少部分双链的核酸分子，所述至少部分双链的核酸分子各自含有第一链和第二链，(ii)含有第一部分的第一引物，所述第一部分与所述多个核酸分子中各核酸分子所述第一链的靶标部分在序列上互补，(iii)第二引物，所述第二引物含有与所述多个核酸分子中各核酸分子所述第二链的靶标部分在序列上互补的序列，(iv)脱氧核苷酸，和(v)DNA聚合酶；在足以使DNA聚合酶延伸所述第一引物和所述第二引物的条件下孵育所述PCR混合物，从而产生所述经加工核酸分子；和纯化所述PCR混合物以去除未使用的第一引物和第二引物，从而产生含有所述起始量的经加工核酸分子的样品。106.如权利要求105所述的方法，其中，所述DNA聚合酶是具有3'外切核酸酶活性的热稳定DNA聚合酶，其产生钝端化的PCR产物。107.如权利要求105所述的方法，其中，所述DNA聚合酶是具有3'腺苷酰化活性的热稳定DNA聚合酶，其产生具有单碱基钝端的PCR产物。108.如权利要求105所述的方法，其中，所述第一引物包含第一部分、第二部分和第三部分，所述第一部分位于所述引物3'端并与所述多个核酸分子中各核酸分子所述第一链的靶标部分在序列上互补，所述第二部分位于所述第一部分5'侧并包含3个或更多个连续核糖核苷酸碱基，所述第三部分位于所述第二部分5'侧并且包含两个或更多个脱氧核苷酸，其中所述DNA聚合酶具有3'外切核酸酶校对活性，并且孵育所述PCR混合物后产生的所述经加工核酸分子各自包含5'突出端，所述5'突出端含有所述第一引物的所述第三部分和所述3个或更多个连续核糖核苷酸碱基中的至少一个。109.如权利要求108所述的方法，其中，所述3个或更多个连续核糖核苷酸碱基包含rU或rA碱基。110.如权利要求108所述的方法，其中，所述DNA聚合酶是DNA聚合酶Q5。111.如权利要求108所述的方法，其中，所述DNA聚合酶是GXLDNA聚合酶。112.如权利要求105所述的方法，其中所述第一引物包含第一部分、第二部分和第三部分，所述第一部分位于所述引物3'端并与所述多个核酸分子中各核酸分子所述第一链的靶标部分在序列上互补，所述第二部分位于所述第一部分5'侧并包含缓冲序列，所述第三部分位于所述第二部分5'侧并包含尾序列，所述尾序列由不同于所述缓冲序列中的核苷酸的核苷酸组成，并且所述第二引物包含第四部分和第五部分，所述第四部分位于所述引物3'端并与所述多个核酸分子中各核酸分子所述第二链的靶标部分在序列上互补，所述第五部分位于所述第四部分5'侧并且包含具有与缓冲序列相同核苷酸组成的序列。113.如权利要求112所述的方法，在纯化所述PCR混合物以去除未使用的第一引物和第二引物后，还包括向包含所述起始量的经加工核酸分子的样品中添加T4DNA聚合酶和脱氧核苷酸，所述脱氧核苷酸与所述缓冲序列的核苷酸互补但不与所述尾序列的核苷酸互补；在足以允许所述T4DNA聚合酶3'外切核酸酶活性修剪所述尾序列并在所述缓冲序列的位置产生5'突出端的条件下孵育包含所述起始量的经加工核酸分子、T4DNA聚合酶和脱氧核苷酸的样品，所述脱氧核苷酸与所述缓冲序列的核苷酸互补但不与所述尾序列的核苷酸互补，其中所述T4DNA聚合酶因其聚合酶活性和所述互补脱氧核苷酸的存在阻止3'外切核酸酶的消化超过所述缓冲序列。114.如权利要求113所述的方法，其中，所述孵育所述第一反应混合物的步骤与孵育包含起始量的经加工核酸分子、T4DNA聚合酶和脱氧核苷酸的样品同时进行，所述脱氧核苷酸与所述缓冲序列的核苷酸互补但不与所述尾序列的核苷酸互补，从而允许在经加工核酸分子上生成5'突出端以及所述探针与所述经加工核酸分子连接。115.如权利要求114所述的方法，其中，所述探针包含由与所述缓冲序列相同的脱氧核苷酸组成的3'端缓冲序列，从而赋予所述探针抵抗所述T4DNA聚合酶3'外切核酸酶活性的抗性。116.如权利要求112所述的方法，其中，所述缓冲序列包括均聚物，二核苷酸或三核苷酸重复序列。117.如权利要求112所述的方法，其中，所述第二引物的第五部分和所述缓冲序列为5至10个碱基长。118.如权利要求112所述的方法，其中，所述尾序列为10至20个碱基长。119.如权利要求105所述的方法，孵育所述PCR混合物后，还包括向所述PCR混合物添加核酸酶；和在足以使所述核酸酶切割所述经加工核酸分子的碱基以产生3'突出端的条件下孵育所述核酸酶和所述PCR混合物，其中所述第一引物还包含可切割的碱基。120.如权利要求119所述的方法，其中，所述可切割的碱基选自脱氧尿苷，核糖核苷酸，肌苷及其组合，并且所述核酸酶选自尿嘧啶DNA糖基化酶，RNA酶和内切核酸酶V。121.如权利要求105所述的方法，孵育所述PCR混合物后，还包括向所述PCR混合物添加5'外切核酸酶；和在足以部分消化各经加工核酸分子以产生3'突出端的条件下孵育所述5'外切核酸酶和所述PCR混合物，其中所述第一引物还包含5'外切核酸酶抗性修饰。122.如权利要求104-121中任一项所述的方法，其中，所述经加工核酸分子是下一代测序(NGS)文库。123.如权利要求122所述的方法，其中，所述经加工核酸分子各自包含位于所述分子第一末端的第一衔接子序列和位于与所述第一末端相对的第二末端的第二衔接子序列，并且所述第一衔接子序列和所述第二衔接子序列相同或不同。124.如权利要求123所述的方法，其中，所述第一衔接子序列是第一下一代测序衔接子，并且所述第二衔接子是第二下一代测序衔接子。125.如权利要求104-121中任一项所述的方法，其中，所述探针包含修饰，所述修饰赋予抵抗被具有外切核酸酶活性的酶消化的抗性。126.如权利要求125所述的方法，其中，所述赋予抵抗被具有外切核酸酶活性的酶消化的抗性的修饰包括三个或更多个连续的硫代磷酸酯连接。127.如权利要求125所述的方法，孵育所述第一反应混合物后，还包括向所述第一反应混合物添加具有外切核酸酶活性的酶以产生第二反应混合物；和在足以允许消化未连接到所述探针的经加工核酸分子的条件下孵育所述第二反应混合物，从而分离所选目标量的经加工核酸分子。128.如权利要求104-106中任一项所述的方法，其中，与所述经加工核酸分子的探针连接是钝端连接，其中所述经加工核酸分子各自包含钝端，并且所述探针包含与所述经加工核酸分子各自的钝端相容的钝端。129.如权利要求104-105和108-118中任一项所述的方法，其中，经加工核酸分子各自包含5'突出端，并且与所述经加工核酸分子的探针连接是粘性末端连接。130.如权利要求104-105和119-121中任一项所述的方法，其中，经加工核酸分子各自包含3'突出端，并且与所述经加工核酸分子的探针连接是粘性末端连接。131.如权利要求104-105和118-121中任一项所述的方法，其中，经加工核酸分子各自包含低复杂性序列，并且所述探针包含与所述低复杂性序列互补的序列从而相比复杂核苷酸序列的杂交速率提高低探针浓度时所述探针与所述经加工核酸分子的杂交速率。132.如权利要求131所述的方法，其中，所述低复杂性序列包括选自下述的序列：多聚(A)，多聚(T)，多聚(G)，多聚(C)，多聚(AG)，多聚(AC)，多聚(GT)，多聚(CT)，多聚(AT)，多聚(GC)，三核苷酸，四核苷酸和五核苷酸，并且所述低复杂性核苷酸序列位于所述突出端的末端位置。133.如权利要求132所述的方法，其中，所述低复杂性序列位于所述经加工核酸分子内部或所述经加工核酸分子的末端。134.如权利要求104-121中任一项所述的方法，所述探针是单链或双链多核苷酸。135.如权利要求104-121中任一项所述的方法，其中，所述纯化PCR混合物以去除未使用的第一引物和第二引物的步骤通过固相可逆固定化进行。136.如权利要求104-121中任一项所述的方法，其中，所述连接酶选自：T4DNA连接酶，T3DNA连接酶，T7DNA连接酶，大肠杆菌DNA连接酶，Taq连接酶，扩增酶，9°N连接酶和PfuDNA连接酶。137.如权利要求104-121中任一项所述的方法，其中，所述探针包含单链DNA。138.如权利要求104-121中任一项所述的方法，其中，所述探针包含单链DNA并且形成发夹结构。139.如权利要求104-121中任一项所述的方法，其中，所述探针包含至少部分双链的DNA。140.如权利要求104-121中任一项所述的方法，其中，探针包含5'磷酸，3'羟基或5'磷酸和3'羟基两者。141.如权利要求104-121中任一项所述的方法，其中所述探针在3'末端还包含C3间隔区或3'磷酸。142.如权利要求104-105和108-118中任一项所述的方法，其中，经加工核酸分子各自包含5'突出端，并且所述5'突出端包含8-50个碱基。143.如权利要求104-105和119-121中任一项所述的方法，其中，经加工核酸分子各自包含3'突出端，并且所述3'突出端包含8-50个碱基。144.如权利要求104-105和108-118中任一项所述的方法，其中，经加工核酸分子各自包含5'突出端，并且所述探针的至少部分与所述5'突出端的至少部分互补。145.如权利要求104-105和119-121中任一项所述的方法，其中，经加工核酸分子各自包含3'突出端，并且所述探针的至少部分与所述3'突出端的至少部分互补。146.如权利要求104-145中任一项所述的方法，其中，所述赋予抵抗被具有外切核酸酶活性的酶消化的抗性的修饰位于所述探针的5'末端。147.如权利要求104-146中任一项所述的方法，其中，所述外切核酸酶选自外切核酸酶III，T4DNA聚合酶和外切核酸酶I。148.如权利要求147的方法，还包括在以所述探针和所述连接酶孵育所述反应复合物后，向所述第一反应混合物添加三磷酸腺苷双磷酸酶二磷酸酶和具有外切核酸酶活性的酶以产生第二反应混合物。149.如权利要求104-148中任一项所述的方法，其中，所述探针长于所述突出端。150.一种产生目标量扩增核酸分子的方法，其包括：(i)选择扩增核酸分子目标量；(ii)提供包含多个核酸分子的样品，所述多个核酸分子中各核酸分子在其第一末端处包含第一衔接子序列并与所述第一末端相对的其第二末端处包含第二衔接子序列；(iii)向所述样品添加脱氧核苷酸、DNA聚合酶、所述目标量的第一引物和所述目标量的第二引物以产生第一PCR反应混合物，其中所述第一引物包含第一5'端结构域和第一3'端结构域，所述第一5'端结构域包含至少与所述第一衔接子序列第一部分互补的第一低复杂性核苷酸序列，所述第一3'端结构域至少与位于所述第一部分5'的所述第一衔接子序列的第二部分互补，其中所述第二引物包含第二5'端结构域和第二3'端结构域，所述第二5'端结构域包含至少与所述第二衔接子序列的第三部分互补的第二低复杂性核苷酸序列，所述第二3'端结构域至少与位于所述第三部分5'的所述第二衔接子序列的第四部分互补，并且所述第一低复杂性核苷酸序列和所述第二低复杂性核苷酸序列不相同且不互补；(iv)在足以使DNA聚合酶延伸所述第一引物和所述第二引物的条件下孵育所述第一PCR反应混合物，从而产生所述目标量的扩增核酸分子，直至所述引物被利用，其中所述低复杂性核苷酸序列选自均聚物序列，二核苷酸序列，重复二核苷酸元件，三核苷酸序列，重复三核苷酸元件，四核苷酸重复序列元件和五核苷酸重复序列元件。151.如权利要求150所述的方法，其中，所述第一5'端结构域和所述第二5'端结构域约为8至100个核苷酸长。152.如权利要求151所述的方法，其中，所述第一5'端结构域和所述第二5'端结构域约为8至90个核苷酸长。153.如权利要求152所述的方法，其中，所述第一5'端结构域和所述第二5'端结构域约为8至80个核苷酸长。154.如权利要求153所述的方法，其中，所述第一5'端结构域和所述第二5'端结构域约为8至70个核苷酸长。155.如权利要求154所述的方法，其中，所述第一5'端结构域和所述第二5'端结构域约为8至60个核苷酸长。156.如权利要求155所述的方法，其中，所述第一5'端结构域和所述第二5'端结构域约为8至50个核苷酸长。157.如权利要求156所述的方法，其中，所述第一5'端结构域和所述第二5'端结构域约为8至40个核苷酸长。158.如权利要求157所述的方法，其中，所述第一5'端结构域和所述第二5'端结构域约为8至30个核苷酸长。159.如权利要求158所述的方法，其中，所述第一5'端结构域和所述第二5'端结构域约为8至20个核苷酸长。160.权利要求150-159中任一项所述的方法，其中，所述第一5'端结构域和/或所述第二5'端结构域包含脱氧核苷酸，核糖核苷酸，锁核酸或其组合。161.如权利要求150-160中任一项所述的方法，其中，所述第一衔接子序列是包含P5序列的Illumina衔接子。162.如权利要求150-161中任一项所述的方法，其中，所述第二衔接子序列是包含P7序列的Illumina衔接子。163.权利要求150-162中任一项所述的方法，其中，所述第一引物在所述第一引物的5'端包含第一荧光团。164.如权利要求163所述的方法，孵育所述第一反应混合物后，还包括：(v)在对应所述第一荧光团的波长测量所述经孵育的第一反应混合物的荧光强度，从而获得第一荧光信号(F1)；vi)向所述经孵育的第一反应混合物添加过量的淬灭寡核苷酸以产生经淬灭混合物，所述淬灭寡核苷酸与所述第一引物至少部分互补；(vii)在对应所述第一荧光团的波长测量所述经猝灭混合物的荧光强度，从而获得第二荧光信号(F2)；如果F2小于F1，则重复步骤(iv)。165.如权利要求164所述的方法，其中，所述第二引物在所述第二引物的5'端包含所述第一荧光团。166.如权利要求150-165中任一项所述的方法，其中，所述足以使所述DNA聚合酶延伸所述第一引物和所述第二引物从而产生所述目标量的扩增核酸分子的条件包括在最初两个PCR循环中的退火持续时间比后续PCR循环中的退火持续时间长。167.如权利要求150-166中任一项所述的方法，其中，所述最初两个PCR循环中的退火持续时间大于1分钟，并且所述后续PCR循环中的退火持续时间为1分钟或更短。168.如权利要求150-167中任一项所述的方法，其中，所述引物被100％利用。169.如权利要求150-167中任一项所述的方法，其中，所述引物被90％利用。170.如权利要求150-167中任一项所述的方法，其中，所述引物被80％利用。171.如权利要求150-167中任一项所述的方法，其中，所述引物被70％利用。172.如权利要求150-167中任一项所述的方法，其中，所述引物被60％利用。173.如权利要求150-167中任一项所述的方法，其中，所述引物被50％利用。174.一种试剂盒，包括：(i)包含多核苷酸序列的探针，其中所述多核苷酸序列包含部分第一下一代测序(NGS)衔接子序列，所述部分是所述第一NGS衔接子具有功能所需的；(ii)包含部分所述第一NGS衔接子序列的第一引物，这部分所述第一NGS衔接子序列不是所述探针中那部分第一NGS衔接子序列；(iii)包含第二NGS衔接子序列的第二引物；(iv)聚合酶；(v)脱氧核苷酸；和(vi)连接酶，其中所述第一NGS衔接子序列和所述第二NGS衔接子序列相同或不同。175.如权利要求174所述的试剂盒，还包含第二脱氧核苷酸混合物；其中所述第一引物还包含尾序列和缓冲序列，所述尾序列的核苷酸组成和所述缓冲序列的核苷酸组成不同，所述第二脱氧核苷酸混合物仅包含与所述缓冲序列互补的核苷酸，所述聚合酶是T4DNA聚合酶，并且所述探针还包含与至少部分所述尾序列互补的序列。176.如权利要求174所述的试剂盒，其中，所述第一引物还包含不处于所述第一引物5'端的3个或更多个连续核糖核苷酸碱基。177.如权利要求174所述的试剂盒，还包含RNA酶，尿嘧啶DNA糖基化酶或内切核酸酶V，其中所述第一引物还包含可切割的碱基，包括核糖核苷酸，尿嘧啶或肌苷。178.如权利要求174所述的试剂盒，还包含5'外切核酸酶，其中所述第一引物还包含内部定位的核酸酶抗性修饰，所述修饰包含1个或更多个硫代磷酸酯连接。179.如权利要求174所述的试剂盒，其中，所述聚合酶是具有3'外切核酸酶校对活性的热稳定高保真聚合酶或Taq聚合酶。180.一种试剂盒，包括：(i)包含多核苷酸序列的探针，其中所述多核苷酸序列包含部分第一下一代测序(NGS)衔接子序列，所述部分是所述第一NGS衔接子具有功能性所需的；(ii)包含部分所述第一NGS衔接子序列的第一引物，这部分所述第一NGS衔接子序列不是所述探针中那部分第一NGS衔接子序列，所述这所述第一NGS衔接子序列中3个或更多个连续碱基被相应的核糖核苷酸碱基取代；(iii)包含第二NGS衔接子序列的第二引物；(iv)具有3'外切核酸酶活性的热稳定高保真聚合酶；(v)脱氧核苷酸；和(vi)连接酶，其中所述第一NGS衔接子序列和所述第二NGS衔接子序列相同或不同。181.如权利要求180所述的试剂盒，其中，所述第一引物还包含尾序列，所述尾序列位于所述被相应核糖核苷酸碱基取代的所述部分所述第一NGS衔接子序列中3个或更多个连续碱基的5'侧，并且所述探针还包含与所述尾序列至少部分互补的序列。182.如权利要求174和176-181中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一引物还包含选自下述的低复杂性序列：多聚(A)，多聚(T)，多聚(G)，多聚(C)，多聚(AG)，多聚(AC)，多聚(GT)，多聚(CT)，多聚(AT)，多聚(GC)，三核苷酸，四核苷酸和五核苷酸，并且所述探针包含与所述低复杂性核苷酸序列互补的序列。183.如权利要求182所述的试剂盒，其中，所述低复杂性序列位于所述部分NGS衔接子序列的5'，并且其中第一下一代测序(NGS)衔接子序列具有功能所需的那部分第一NGS衔接子序列位于与所述低复杂性序列互补的序列的5'。184.如权利要求174-183中任一项所述的试剂盒，其中，所述探针包含8-50个碱基。185.如权利要求174-184中任一项的所述的试剂盒，其中，所述连接酶选自：T4DNA连接酶，T3DNA连接酶，T7DNA连接酶，大肠杆菌DNA连接酶，Taq连接酶，扩增酶，9°N连接酶和PfuDNA连接酶。186.如权利要求174-185中任一项的所述的试剂盒，其中探针还包含5'磷酸，3'羟基或5'磷酸和3'羟基两者。187.如权利要求174-186中任一项所述的试剂盒，其中，所述探针包含单链DNA。188.如权利要求174-187中任一项所述的试剂盒，其中，所述探针形成发夹结构。189.如权利要求174-186中任一项所述的试剂盒，其中，所述探针是至少部分双链的。190.如权利要求189所述的试剂盒，其中所述探针还包含5'突出端。191.一种试剂盒，包括：(i)第一引物，其包含位于3'末端的第一部分，位于所述第一部分5'并包含3个或更多个连续核糖核苷酸的第二部分，和位于所述第二部分5'并包含两个或更多个脱氧核苷酸的第三部分；(ii)脱氧核苷酸；(iii)具有3'外切核酸酶校对活性的DNA聚合酶；(iv)探针，其包含与所述第一引物至少部分互补的多核苷酸序列以及修饰，互补所在部分不是所述第一部分，所述修饰赋予抵抗被具有3'外切酶活性的酶消化的抗性；(v)连接酶；(vi)3'外切核酸酶；和任选地(vii)外切核酸酶I或固相可逆固定珠。192.如权利要求191所述的试剂盒，其中，所述DNA聚合酶是DNA聚合酶Q5。193.如权利要求191所述的试剂盒，其中，所述DNA聚合酶是GXLDNA聚合酶。194.如权利要求191-193中任一项所述的试剂盒，其中，所述3个或更多个连续核糖核苷酸包含rU或rA碱基。195.如权利要求191-194中任一项所述的试剂盒，其中，与所述第一引物至少部分互补的所述多核苷酸序列是选自下述的低复杂性序列：多聚(A)，多聚(T)，多聚(G)，多聚(C)，多聚(AG)，多聚(AC)，多聚(GT)，多聚(CT)，多聚(AT)，多聚(GC)，三核苷酸，四核苷酸和五核苷酸。196.如权利要求191-195中任一项所述的试剂盒，其中，所述探针包含8-50个碱基。197.如权利要求191-196中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一引物的所述第二部分和所述第三部分总共包含8-50个碱基。198.如权利要求191-197中任一项的所述的试剂盒，其中，所述连接酶选自：T4DNA连接酶，T3DNA连接酶，T7DNA连接酶，大肠杆菌DNA连接酶，Taq连接酶，扩增酶，9°N连接酶和PfuDNA连接酶。199.如权利要求191-198中任一项的所述的试剂盒，其中探针还包含5'磷酸，3'羟基或5'磷酸和3'羟基两者。200.如权利要求191-199中任一项所述的试剂盒，其中，所述赋予抵抗被具有3'外切核酸酶活性的酶消化的抗性的修饰包括三个或更多个核酸酶抗性修饰。201.如权利要求200所述的试剂盒，其中，所述赋予抵抗被具有3'外切核酸酶活性的酶消化的抗性的修饰包括三个或更多个硫代磷酸酯连接。202.如权利要求191-201中任一项所述的试剂盒，其中，所述赋予抵抗被具有3'外切核酸酶活性的酶消化的抗性的修饰位于所述探针的3'末端。203.如权利要求191-201中任一项所述的试剂盒，其中，所述赋予抵抗被具有3'外切核酸酶活性的酶消化的抗性的修饰位于所述探针的5'末端、3'末端或内部。204.如权利要求191-203中任一项所述的试剂盒，其中，所述外切核酸酶选自外切核酸酶III，T4DNA聚合酶和外切核酸酶I。205.如权利要求191-204中任一项所述的试剂盒，其中，所述探针包含单链DNA。206.如权利要求191-205中任一项所述的试剂盒，其中，所述探针形成发夹结构。207.如权利要求191-204中任一项所述的试剂盒，其中，所述探针是至少部分双链的。208.如权利要求207所述的试剂盒，其中所述探针还包含5'突出端。209.如权利要求191-208中任一项所述的试剂盒，还包括第二引物。210.如权利要求209所述的试剂盒，其中，所述第二引物包含第四部分、位于所述第四部分5'的第五部分和位于所述第五部分5'的第六部分，所述第五部分与所述第一引物的所述第二部分相同，所述第六部分与所述第一引物的所述第三部分相同。211.一种试剂盒，包括：(i)第一引物，其包含位于3'末端的第一部分、位于所述第一部分5'并包含缓冲序列的第二部分和位于所述第二部分5'并包含尾序列的第三部分，所述尾序列由不同于所述缓冲序列中核苷酸的核苷酸组成；(ii)与所述缓冲序列的核苷酸互补且不与所述尾序列的核苷酸互补的脱氧核苷酸；(iii)T4DNA聚合酶；(iv)探针，其包含与所述第一引物至少部分互补的多核苷酸序列以及修饰，互补所在部分不是所述第一部分，所述修饰赋予抵抗被具有3'外切酶活性的酶消化的抗性；(v)连接酶；(vi)3'外切核酸酶(vii)具有3'外切核酸酶校对活性的热稳定高保真聚合酶；(vii)脱氧核苷酸；和任选地(vii)外切核酸酶I或固相可逆固定珠。212.如权利要求211所述的试剂盒，其中，所述尾序列是选自下述的低复杂性序列：多聚(A)，多聚(T)，多聚(G)，多聚(C)，多聚(AG)，多聚(AC)，多聚(GT)，多聚(CT)，多聚(AT)，多聚(GC)，三核苷酸，四核苷酸和五核苷酸。213.如权利要求211-212中任一项所述的试剂盒，其中，所述缓冲序列包括均聚物，二核苷酸或三核苷酸组成。214.如权利要求211-213中任一项所述的试剂盒，其中，所述尾序列为10-20个碱基长。215.如权利要求211-214中任一项所述的试剂盒，其中，所述缓冲序列为5至10个碱基长。216.如权利要求211-215中任一项所述的试剂盒，其中，所述探针包含8-50个碱基。217.如权利要求211-216中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一引物的所述第二部分和所述第三部分总共包含8-50个碱基。218.如权利要求211-217中任一项的所述的试剂盒，其中，所述连接酶选自：T4DNA连接酶，T3DNA连接酶，T7DNA连接酶，大肠杆菌DNA连接酶，Taq连接酶，扩增酶，9°N连接酶和PfuDNA连接酶。219.如权利要求211-218中任一项的所述的试剂盒，其中探针还包含5'磷酸，3'羟基或5'磷酸和3'羟基两者。220.如权利要求211-219中任一项所述的试剂盒，其中，所述赋予抵抗被具有3'外切核酸酶活性的酶消化的抗性的修饰包括三个或更多个核酸酶抗性修饰。221.如权利要求220所述的试剂盒，其中，所述赋予抵抗被具有3'外切核酸酶活性的酶消化的抗性的修饰包括三个或更多个硫代磷酸酯连接。222.如权利要求211-221中任一项所述的试剂盒，其中，所述赋予抵抗被具有3'外切核酸酶活性的酶消化的抗性的修饰位于所述探针的3'末端、5'末端或内部。223.如权利要求211-222中任一项所述的试剂盒，其中，所述外切核酸酶选自外切核酸酶III，T4DNA聚合酶和外切核酸酶I。224....
【专利技术属性】
技术研发人员：V·马卡洛夫，S·楚普瑞塔，
申请(专利权)人：斯威夫特生物科学股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US
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