一种阿片类活性物质的通用检测方法及其检测试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种阿片类活性物质的通用检测方法及其检测试剂盒，检测试剂盒分为检测组试剂和对照组试剂两种成分，检测组试剂包括稳定表达人源μ型阿片受体MOR1基因的单克隆细胞系MOR1•copGFP/293和细胞内游离钙离子检测荧光探针试剂Fura Red，对照组试剂包括空白对照单克隆细胞系copGFP/293和细胞内游离钙离子检测荧光探针试剂Fura Red；空白对照单克隆细胞系copGFP/293的制备方法为：将pCDH‑CMV‑MCS‑EF1‑copGFP质粒、pH1质粒、pH2质粒共转染至慢病毒包装细胞293V，制备得到EF1‑copGFP慢病毒；将EF1‑copGFP慢病毒感染人胚肾细胞293，得到所述空白对照单克隆细胞系copGFP/293。本发明专利技术可实现所有阿片类活性物质的精确、高灵敏的快速检测，可解决新型合成阿片类精神活性物质监管难的问题。

A General Detection Method for Opioid Active Substances and Its Kit

【技术实现步骤摘要】
一种阿片类活性物质的通用检测方法及其检测试剂盒
本专利技术属于生物
，具体涉及一种阿片类活性物质的通用检测方法及其检测试剂盒。
技术介绍
对于吸毒人员吸食新型阿片类精神物质，如芬太尼的检测和监管是各国监管部门的难题。因为目前的检测手段主要依赖于抗体(如抗芬太尼抗体)的免疫法，包括层析法、ELISA法等；以及气质联用、液质联用等大型仪器分析。但芬太尼在人体内代谢较快，造成检测样本中目标检测成分含量极低，无法检测到。另一方面，新型合成的芬太尼层出不穷，且分子结构多样，使基于抗体的免疫检测法几乎不可能，甚至气质联用、液质联用也难以实现监管检测。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述技术问题，本专利技术的目的在于提供一种阿片类活性物质的通用检测方法及其检测试剂盒。本专利技术构思为：无论是天然阿片类物质，还是各种各样的合成阿片类精神物质，如芬太尼及其衍生物，其在机体内都会作用到阿片受体这个靶点，从而产生其生物学效应。阿片受体至少包括μ型、k型、δ型、和σ型四种阿片受体，μ型阿片受体是吗啡、芬太尼等阿片类精神物质亲和力和作用最强的受体。阿片受体属于GPCR类，当受到阿片类分子激动剂作用后信号通路激活，即通过IP3-DAG信号使内质网内储存的Ca2+迅速释放到的细胞质，胞质内游离钙离子浓度升高，从而产生细胞应答。由于有非常多的钙离子指示剂可用于胞质内游离钙离子浓度的测定，因而我们通过建立同时表达绿色荧光蛋白copGFP稳转MOR1的细胞系，以copGFP为内参质控，FuraRed为钙离子荧光指示剂；单波长激发，双波长检测，以荧光钙与copGFP的荧光比值为测定参数，建立一种新型的快速简便、高效精准、高通量通用的阿片类活性物质检测方法。所述的一种阿片类活性物质的通用检测方法，其特征在于包括以下步骤：1）将阿片受体基因MOR1克隆到一个含有EF1启动表达荧光蛋白的载体的CMV启动子下，构建表达质粒；2）将步骤1）构建的带荧光蛋白基因的质粒转染到真核永生化细胞，并建立EF1-荧光蛋白基因稳转细胞系，进行培养扩增得到检测组培养液；同样建立转染空白对照质粒，建立空白对照EF1-荧光蛋白基因稳转细胞系，进行培养扩增得到对照组培养液；3）步骤2）检测组培养液中加入标准品，标准品为吗啡或芬太尼，配制一系列不同标准品浓度的检测组标准液；检测组标准液中分别加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应后，进行检测胞内荧光蛋白的荧光值PF和荧光钙离子的荧光值Ca2+F，以测得的荧光值Ca2+F/荧光值PF比值作为纵坐标，以标准品的浓度为横坐标绘制标准曲线，计算拟合回归方程；4）步骤2）检测组培养液和对照组培养液中分别加入待测样本，分别配制得到样本液和对照液，样本液中的待测样本浓度与对照液中的待测样本浓度相同；样本液和对照液中分别加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应后，对反应后的样本液进行检测胞内荧光蛋白的荧光值PF1和荧光钙离子的荧光值Ca2+F1，对反应后的对照液进行检测胞内荧光蛋白的荧光值PF2和荧光钙离子的荧光值Ca2+F2，计算得到荧光值Ca2+F1/荧光值PF1比值与荧光值Ca2+F2/荧光值PF2比值之差，并代入步骤3）回归方程，即可计算出检测样本中的阿片类活性物质含量。所述的一种阿片类活性物质的通用检测方法，其特征在于步骤1）中，阿片受体基因MOR1为人源μ型阿片受体MOR1基因；荧光蛋白为copGFP。所述的一种阿片类活性物质的通用检测方法，其特征在于步骤1）构建的质粒为pCMV-MOR1·EF1-copGFP质粒，其制备过程为：将人源μ型阿片受体MOR1基因克隆到慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP的CMV启动子下，连接酶切位点为EcoRI和NotI，构建真核表达所述pCMV-MOR1·EF1-copGFP质粒。所述的一种阿片类活性物质的通用检测方法，其特征在于步骤2）中，所述真核永生化细胞为慢病毒包装细胞293V，建立EF1-荧光蛋白基因稳转细胞系的过程为：将pCMV-MOR1·EF1-copGFP质粒、pH1质粒、pH2质粒共转染至慢病毒包装细胞293V，制备得到CMV-MOR1·EF1-copGFP慢病毒，将CMV-MOR1·EF1-copGFP慢病毒感染人胚肾细胞293；并在荧光显微镜下通过挑取克隆的方法获得稳定表达人源μ型阿片受体MOR1基因的单克隆细胞系MOR1·copGFP/293。所述的一种阿片类活性物质的通用检测方法，其特征在于步骤2）中，所述空白对照质粒为pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP质粒，建立空白对照EF1-荧光蛋白基因稳转细胞系的过程为：将pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP质粒、pH1质粒、pH2质粒共转染至慢病毒包装细胞293V，制备得到EF1-copGFP慢病毒；将EF1-copGFP慢病毒感染人胚肾细胞293，得到空白对照单克隆细胞系copGFP/293。所述的一种阿片类活性物质的通用检测方法，其特征在于步骤3）中，向检测组培养液加入标准品，配制标准品浓度分别为0.01ng/ml、0.05ng/ml、0.25ng/ml、1.25ng/ml和6.25ng/ml的5种检测组标准液，所述标准品为吗啡。所述的一种阿片类活性物质的通用检测方法，其特征在于步骤3）中，向检测组培养液加入标准品，配制标准品浓度分别为1pg/ml、3pg/ml、9pg/ml、27pg/ml和81pg/ml的5种检测组标准液，所述标准品为芬太尼。所述的一种阿片类活性物质的通用检测方法，其特征在于步骤3）和步骤4）中的细胞内游离钙离子探针试剂均为FuraRed；步骤3）中，进行检测胞内荧光蛋白的荧光值PF和荧光钙离子的荧光值Ca2+F的方法为：用荧光酶标仪进行测试，选择482nm单波长激发，以507nm和640nm双波长检测，其中507nm波长下检测胞内荧光蛋白的荧光值PF，640nm波长下检测荧光钙离子的荧光值Ca2+F。所述的一种阿片类活性物质的通用检测方法，其特征在于步骤4）中，所述待测样本为吸毒人员的尿液、血液、毛发、头皮屑、汗液或唾液，或者为天然阿片类制品、合成阿片类制品、污水、土壤、水塘中的任意一种。所述的一种阿片类活性物质的检测试剂盒，其特征在于所述检测试剂盒分为检测组试剂和对照组试剂两种成分，所述检测组试剂包括稳定表达人源μ型阿片受体MOR1基因的单克隆细胞系MOR1·copGFP/293和细胞内游离钙离子检测荧光探针试剂FuraRed，所述对照组试剂包括空白对照单克隆细胞系copGFP/293和细胞内游离钙离子检测荧光探针试剂FuraRed；所述空白对照单克隆细胞系copGFP/293的制备方法为：将pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP质粒、pH1质粒、pH2质粒共转染至慢病毒包装细胞293V，制备得到EF1-copGFP慢病毒；将EF1-copGFP慢病毒感染人胚肾细胞293，得到所述空白对照单克隆细胞系copGFP/293。相对于现有技术，本专利技术取得的有益效果是：(1)避免了免疫检测法依赖于抗体的局限，可直接对所有阿片类活性物质进行通用检测，没有非特异性结合问题，无需昂贵人力物力和繁复长周期的抗体研发过程；同时也避免了气质联用、液质联用法依赖于对本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种阿片类活性物质的通用检测方法，其特征在于包括以下步骤：1）将阿片受体基因MOR1克隆到一个含有EF1启动表达荧光蛋白的载体的CMV启动子下，构建表达质粒；2）将步骤1）构建的带荧光蛋白基因的质粒转染到真核永生化细胞，并建立EF1‑荧光蛋白基因稳转细胞系，进行培养扩增得到检测组培养液；同样建立转染空白对照质粒，建立空白对照EF1‑荧光蛋白基因稳转细胞系，进行培养扩增得到对照组培养液；3）步骤2）检测组培养液中加入标准品，标准品为吗啡或芬太尼，配制一系列不同标准品浓度的检测组标准液；检测组标准液中分别加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应后，进行检测胞内荧光蛋白的荧光值PF和荧光钙离子的荧光值Ca

【技术特征摘要】
1.一种阿片类活性物质的通用检测方法，其特征在于包括以下步骤：1）将阿片受体基因MOR1克隆到一个含有EF1启动表达荧光蛋白的载体的CMV启动子下，构建表达质粒；2）将步骤1）构建的带荧光蛋白基因的质粒转染到真核永生化细胞，并建立EF1-荧光蛋白基因稳转细胞系，进行培养扩增得到检测组培养液；同样建立转染空白对照质粒，建立空白对照EF1-荧光蛋白基因稳转细胞系，进行培养扩增得到对照组培养液；3）步骤2）检测组培养液中加入标准品，标准品为吗啡或芬太尼，配制一系列不同标准品浓度的检测组标准液；检测组标准液中分别加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应后，进行检测胞内荧光蛋白的荧光值PF和荧光钙离子的荧光值Ca2+F，以测得的荧光值Ca2+F/荧光值PF比值作为纵坐标，以标准品的浓度为横坐标绘制标准曲线，计算拟合回归方程；4）步骤2）检测组培养液和对照组培养液中分别加入待测样本，分别配制得到样本液和对照液，样本液中的待测样本浓度与对照液中的待测样本浓度相同；样本液和对照液中分别加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应后，对反应后的样本液进行检测胞内荧光蛋白的荧光值PF1和荧光钙离子的荧光值Ca2+F1，对反应后的对照液进行检测胞内荧光蛋白的荧光值PF2和荧光钙离子的荧光值Ca2+F2，计算得到荧光值Ca2+F1/荧光值PF1比值与荧光值Ca2+F2/荧光值PF2比值之差，并代入步骤3）回归方程，即可计算出检测样本中的阿片类活性物质含量。2.根据权利要求1所述的一种阿片类活性物质的通用检测方法，其特征在于步骤1）中，阿片受体基因MOR1为人源μ型阿片受体MOR1基因；荧光蛋白为copGFP。3.根据权利要求1所述的一种阿片类活性物质的通用检测方法，其特征在于步骤1）构建的质粒为pCMV-MOR1·EF1-copGFP质粒，其制备过程为：将人源μ型阿片受体MOR1基因克隆到慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP的CMV启动子下，连接酶切位点为EcoRI和NotI，构建真核表达所述pCMV-MOR1·EF1-copGFP质粒。4.根据权利要求1所述的一种阿片类活性物质的通用检测方法，其特征在于步骤2）中，所述真核永生化细胞为慢病毒包装细胞293V，建立EF1-荧光蛋白基因稳转细胞系的过程为：将pCMV-MOR1·EF1-copGFP质粒、pH1质粒、pH2质粒共转染至慢病毒包装细胞293V，制备得到CMV-MOR1·EF1-copGFP慢病毒，将CMV-MOR1·EF1-copGFP慢病毒感染人胚肾细胞293；并在荧光显微镜下通过挑取克隆的方法获得稳定表达人源μ型阿片受体MOR1基因的单克隆细胞系...

【专利技术属性】
技术研发人员：范春雷，
申请(专利权)人：杭州迈尔德生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33