本发明专利技术公开了一种利用12‑羟基硬脂酸制备γ‑癸内酯的生物转化方法，其特征在于，配制培养基，其中，甘油1‑20g/L，七水硫酸镁2‑15g/L，L‑肉碱0.01‑0.05g/L，磷酸二氢钾0.1‑5g/L，磷酸氢二钾5‑40g/L；将12‑羟基硬脂酸加入到培养基中；将酵母FM‑Y11加入到含有底物的培养基中进行培养。本发明专利技术以酵母利用羟基硬脂酸制备γ‑癸内酯，以12‑羟基硬脂酸为底物，提供了一种新的底物生产γ‑癸内酯的生物转化方法，其相较于传统的底物蓖麻油酸等更有利于产物与底物的分离。本发明专利技术不仅保留了产品的天然、单纯的特性，又具有生物转化周期短、原料成本低等优点。
Biotransformation of gamma-decanolide from 12-hydroxy stearic acid
【技术实现步骤摘要】
利用12-羟基硬脂酸制备γ-癸内酯的生物转化方法
本专利技术属于微生物生物转化工程
，特别是涉及一种固相底物制备γ-癸内酯的生物转化方法，具体提供了一种生产γ-癸内酯的方法。
技术介绍
内酯是羟基脂肪酸分子经过分子内酯化形成的化合物，根据羟基位置的不同可分为γ-内酯，δ-内酯和ω-内酯等。内酯是广泛存在于自然界中具有生物活性的一类化合物。γ-内酯和δ-内酯通常具有水果香味，而某些大环ω-内酯具有麝香香味。它们在食品和化妆品工业中有重要的应用价值，某些昆虫性激素和植物生长调节剂也是内酯化合物。大多数内酯化合物具有手性，它们的生理活性经常取决于分子的绝对构型。内酯化合物具有浓郁的香气，在各种水果味、可可味、奶酪味、甜味、及坚果味的食品体系中都曾分离到内酯。目前，内酯化合物主要由化学方法合成。但是，用微生物可以产生具有最适活性的相对较纯的产物；同时，微生物可以完成需要许多步骤的化学合成的生产过程。其中，γ-癸内酯是香料工业由生物技术得到的主要产品。γ-癸内酯(γ-Decalactone，GDL)是一种内酯类香味物质，为无色液体，呈愉快的椰子和桃子香气。它是一个含有五元内酯环的十碳化合物，分子式为C10H18O2,分子量为170.25。天然香料γ-癸内酯大规模工业化量产的最有潜力的方式是通过微生物转化。羟基脂肪酸，非羟基脂肪酸等都可作为生物转化底物制取γ-癸内酯。关于利用微生物法制备γ-癸内酯，普遍报道中利用蓖麻油、蓖麻油酸以及蓖麻油酸甲酯为底物制备γ-癸内酯，在生物转化培养基中对底物蓖麻油酸有效浓度的控释、高浓度产物对酵母细胞产生的强烈反馈抑制作用、底物的毒性作用以及底物与γ-癸内酯的分离提纯都是制约着γ-癸内酯实现工业化生产的瓶颈。针对现有技术中的上述技术问题，本专利技术以12-羟基硬脂酸为底物，通过固(12-羟基硬脂酸)液(培养基)体系，有利于产物与底物的分离与提纯。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：现有技术中制备γ-癸内酯的方法成本高，转化时间长，分离困难等问题。为了解决上述问题，本专利技术提供了一种利用12-羟基硬脂酸制备γ-癸内酯的生物转化方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1)：将12-羟基硬脂酸粉碎后，分筛；步骤2)：配制培养基，其中，甘油1-20g/L，七水硫酸镁2-15g/L，L-肉碱0.01-0.05g/L，磷酸二氢钾0.1-5g/L，磷酸氢二钾5-40g/L，调节pH值，灭菌；步骤3)：将步骤1)得到的12-羟基硬脂酸加入到步骤2)中得到的培养基中，12-羟基硬脂酸的加入量为10-60g/L；步骤4)：将酵母FM-Y11以1-30g/L的加入量加入到步骤3)得到的含有底物的培养基中进行培养。优选地，所述步骤1)12-羟基硬脂酸经过粉碎后筛选出20-200目。优选地，所述步骤2)中的培养基调节pH值为6.0-8.5。优选地，所述步骤4)中加入酵母FM-Y11之前先加入相转移催化剂，加入量为培养基的1-10wt％。更优选地，所述相转移催化剂为十二烷基三甲基氯乙胺、四丁基溴化铵、四丁基硫酸氢铵、十四烷基三甲基氯化铵、四丁基氯化铵、聚乙二醇200、聚乙二醇400或聚乙二醇2000。优选地，还包括步骤5)：在步骤4)得到的培养基中加入0.1-5wt％的大孔吸附树脂进行培养。更优选地，所述大孔吸附树脂为BS-80-7。更优选地，所述步骤5)中培养的条件为：转速180-250r/min，温度25-35℃，培养时间不超过72h。优选地，所述步骤4)中培养的条件为：转速180-250r/min，温度25-35℃，培养时间为12-108h。更优选地，所述步骤4)中培养的时间为24h。本专利技术以酵母利用羟基硬脂酸制备γ-癸内酯，以12-羟基硬脂酸为底物，提供了一种新的底物生产γ-癸内酯的生物转化方法，其相较于传统的底物蓖麻油酸等更有利于产物与底物的分离。利用12-羟基硬脂酸转化生产的天然γ-癸内酯不仅保留了产品的天然、单纯的特性，又具有生物转化周期短、原料成本低等优点，为利用微生物转化生产γ-癸内酯提供了新的思路。附图说明图1为实施例1获得的γ-癸内酯离子碎片气质图；图2为实施例2获得的γ-癸内酯在不同12-羟基硬脂酸粒径下生成图；图3为实施例3获得的γ-癸内酯在不同浓度底物12-羟基硬脂酸下生成图；图4为实施例4获得的γ-癸内酯0～96小时的生成曲线对比图；图5为实施例6获得的添加树脂与未添加树脂的γ-癸内酯0～72小时的生成曲线对比图。具体实施方式为使本专利技术更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。实施例1-6中采用的酵母FM-Y11是为市售微生物，其它各原料、试剂均为市售产品。实施例1：固-液两相生物转化体系制备γ-癸内酯的检测将12-羟基硬脂酸进行粉碎，经过100目筛得到12-羟基硬脂酸粉末；将10g/L甘油，15g/L七水硫酸镁，0.05g/LL-肉碱，0.42g/L磷酸二氢钾，7.21g/L磷酸氢二钾配制转化培养基，调节pH值为7.0，将培养基进行灭菌。将10g/L12-羟基硬脂酸与5g/L的FM-Y11酵母加入培养基中，在摇瓶中进行好氧生物转化，温度控制在30℃，摇床转速为200rpm/min，培养48h。生物转化结束后，将得到的含有有γ-癸内酯的培养液，用一倍体积的环己烷萃取，取有机相进行气相以及气质检测，结果如图1所示。由图1可知，质荷比为85的峰代表产物中C6H13和C4H5O2，是由于C4和C5之间化学键断裂造成的，其作为质谱图中丰度最大的碎片离子峰，是GDL的特征峰，并且该物质的碎片离子峰谱图与GDL的碎片离子峰匹配度为91％，因此转化产物确定为GDL。实施例2：不同12-羟基硬脂酸粒径大小对转化γ-癸内酯的影响将12-羟基硬脂酸进行粉碎，分别得到20-80目、80-120目、120-180目、180目以上的12-羟基硬脂酸粉末；将10g/L甘油，15g/L七水硫酸镁，0.05g/LL-肉碱，0.42g/L磷酸二氢钾，7.21g/L磷酸氢二钾配制转化培养基，调节pH值为7.0，将培养基进行灭菌。后将25g/L12-羟基硬脂酸加入培养基中，再加入15g/L的FM-Y11酵母加入培养基中，在摇瓶中进行好氧生物转化，并于同上所述培养基中加入25g/L120目以上的12-羟基硬脂酸作为对照组，温度控制在30℃，摇床转速为200rpm/min，培养36h。生物转化结束后，将得到的含有有γ-癸内酯的培养液，用一倍环己烷萃取，取有机相进行气相检测，结果如图2所示。由图2可知，当转化培养基中的12-羟基硬脂酸在20-80目之间，测得的培养液中的γ-癸内酯含量为0.85g/L，当转化培养基中的12-羟基硬脂酸在80-120目之间，测得的培养液中的γ-癸内酯含量为0.90g/L，当转化培养基中的12-羟基硬脂酸在120-180目之间，测得的培养液中的γ-癸内酯含量为1.17g/L，当转化培养基中的12-羟基硬脂酸在180-200目之间，测得的培养液中的γ-癸内酯含量为1.17g/L；实验结果表明，转化培养基中添加底物粒径的大小对γ-癸内酯的产量有很大的影响，将片状12-羟基硬脂酸进行粉碎可提高γ-癸内酯的产量，本实验案例中当12-羟基硬脂酸的粒径在120目以上时，转化较片状的12本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种利用12‑羟基硬脂酸制备γ‑癸内酯的生物转化方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1)：将12‑羟基硬脂酸粉碎后，分筛；步骤2)：配制培养基，其中，甘油1‑20g/L，七水硫酸镁2‑15g/L，L‑肉碱0.01‑0.05g/L，磷酸二氢钾0.1‑5g/L，磷酸氢二钾5‑40g/L，调节pH值，灭菌；步骤3)：将步骤1)得到的12‑羟基硬脂酸加入到步骤2)中得到的培养基中，12‑羟基硬脂酸的加入量为10‑60g/L；步骤4)：将酵母FM‑Y11以1‑30g/L的加入量加入到步骤3)得到的含有底物的培养基中进行培养。
【技术特征摘要】
1.一种利用12-羟基硬脂酸制备γ-癸内酯的生物转化方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1)：将12-羟基硬脂酸粉碎后，分筛；步骤2)：配制培养基，其中，甘油1-20g/L，七水硫酸镁2-15g/L，L-肉碱0.01-0.05g/L，磷酸二氢钾0.1-5g/L，磷酸氢二钾5-40g/L，调节pH值，灭菌；步骤3)：将步骤1)得到的12-羟基硬脂酸加入到步骤2)中得到的培养基中，12-羟基硬脂酸的加入量为10-60g/L；步骤4)：将酵母FM-Y11以1-30g/L的加入量加入到步骤3)得到的含有底物的培养基中进行培养。2.如权利要求1所述的利用12-羟基硬脂酸制备γ-癸内酯的生物转化方法，其特征在于，所述步骤1)12-羟基硬脂酸经过粉碎后筛选出20-200目。3.如权利要求1所述的利用12-羟基硬脂酸制备γ-癸内酯的生物转化方法，其特征在于，所述步骤2)中的培养基调节pH值为6.0-8.5。4.如权利要求1所述的利用12-羟基硬脂酸制备γ-癸内酯的生物转化方法，其特征在于，所述步骤4)中加入酵母FM-Y11之前先加入相转移催化剂，加入量为培养基的1-10wt％。5.如权利要求4...
【专利技术属性】
技术研发人员：荣绍丰，管鑫慧，张硕，管世敏，蔡宝国，李茜茜，
申请(专利权)人：上海应用技术大学，
类型：发明
国别省市：上海,31
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