本发明专利技术提供水稻基因OsGRF4在提高植物耐冷性中的应用。本发明专利技术涉及的水稻基因OsGRF4为穗部性状调控基因，来源于籼稻品种川大粒，该基因表达量的升高导致水稻耐冷性的增强。实验结果表明，在冷胁迫下OsGRF4超表达转基因株系的存活率显著高于野生型，而OsGRF4抑制表达转基因株系的存活率显著低于野生型，本发明专利技术首次证明OsGRF4基因具有增强水稻耐冷性的功能。OsGRF4基因对于培育耐冷水稻品种具有较大的应用前景，本发明专利技术为植物抗寒育种，特别是水稻抗寒育种提供了新的基因资源。
Application of Rice Gene OsGRF4 in Improving Plant Cold Tolerance
【技术实现步骤摘要】
水稻基因OsGRF4在提高植物耐冷性中的应用
本专利技术属于植物基因工程领域，具体地说，涉及水稻基因OsGRF4在提高植物耐冷性中的应用。
技术介绍
据世界实时统计数据库公布，2019年1月，全世界的人口达到了77.15亿。按照每年1亿的增长趋势，到2050年，全球人口总数将接近100亿。据预测，到本世纪中叶，全世界的农业水平要比2005年提高60％-120％才能养活这100亿人口。水稻是最重要的粮食作物之一，全球有一半以上的人口以稻米作为主食，稻谷的产量关系到世界的粮食安全。水稻起源于热带、亚热带，是喜温植物，对低温很敏感。低温冷害严重制约着水稻的播种面积和播种范围，同时严重影响水稻的高产与稳产。仅以我国为例，每年因冷害导致稻谷减产50-100亿公斤(赵正武等，西南农业学报，2006,19:330-335)。因此，当前迫切需要挖掘更多的耐冷功能基因、培育耐冷品种以减少冷害对水稻产量造成的损失。根据水稻的生长阶段，可以将水稻冷害分为芽期冷害、苗期冷害和生殖期冷害。水稻的耐冷性多由数量性状位点控制，目前，研究者利用籼/粳(少数为粳/粳或野/栽)遗传群体或者利用自然群体进行连锁分析或者关联分析，定位到较多的耐冷QTL(Lvetal.,PlantCellEnviron,2016,39(3):556-570；Wangetal.,Rice,2016,9(1):61)。然而，已克隆的耐冷QTL甚少，严重制约了水稻耐冷性的分子育种进程。因此，迫切需要加快水稻耐冷资源的引进、创制与评价，挖掘更多新的水稻耐冷基因，为明晰水稻耐冷分子机理和调控网络奠定基础，也为更好更快地培育耐冷性增强的水稻新品种提供基因资源和技术支持，对保障我国粮食安全有着十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供水稻基因OsGRF4在提高植物耐冷性中的应用。为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供水稻基因OsGRF4在提高植物耐冷性中的应用。其中，所述水稻基因OsGRF4为水稻穗部性状调控基因，来源于籼稻品种川大粒。OsGRF4为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：(a)由SEQIDNO:3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)SEQIDNO:3所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。可选地，所述水稻基因OsGRF4的核苷酸序列包含从下组核苷酸序列(1)-(7)中选择的核苷酸序列：(1)SEQIDNO:1或SEQIDNO:2所示的核苷酸序列；(2)在严格条件下与(1)的核苷酸杂交且编码植物耐冷相关蛋白的核苷酸序列；(3)与(1)的核苷酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、尤其是至少95％或98％或99％同一性的核苷酸序列；(4)与(1)的核苷酸序列编码相同氨基酸序列的蛋白质、但因遗传密码子的简并性而在序列上不同的核苷酸序列；(5)编码如下氨基酸序列之一的核苷酸序列：SEQIDNO:3所示的氨基酸序列，或者，由于一个或多个(例如1-25个、1-20个，1-15个，1-10个，1-5个，1-3个)氨基酸残基的替代、缺失和/或插入而与SEQIDNO:3所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列，或者，与SEQIDNO:3所示的氨基酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、尤其是至少95％或98％同一性的氨基酸序列；(6)(1)-(5)任一核苷酸序列的活性片段；或(7)与(1)-(5)任一核苷酸序列互补的核苷酸序列。其中，(2)-(7)中定义的核苷酸序列具有增强植物耐冷性的功能。本专利技术中，所述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。本专利技术中，所述植物包括但不限于水稻、玉米、高粱、小麦和大麦。第二方面，本专利技术提供一种提高植物耐冷性的方法，所述方法包括：1)使植物包含水稻基因OsGRF4；或2)使植物表达水稻基因OsGRF4。前述的方法，所述方法包括但不限于转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。进一步地，所述方法包括利用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、基因枪、电导、农杆菌介导等常规生物学方法将包含水稻基因OsGRF4的重组表达载体导入植物细胞，获得转基因植株；或者，将含有水稻基因OsGRF4的植株与另一植株杂交，获得杂交后代。所获得的后代植株其耐冷性得到改良。第三方面，本专利技术提供水稻基因OsGRF4的启动子，所述启动子为：i)SEQIDNO:4所示的核苷酸序列；ii)SEQIDNO:4所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且具有启动子活性的核苷酸序列；iii)在严格条件下与SEQIDNO:4所示序列杂交且具有启动子活性的核苷酸序列；iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、尤其是至少95％或98％或99％同一性的核苷酸序列；v)i)～iv)任一核苷酸序列的活性片段；或vi)与i)～iv)任一核苷酸序列互补的核苷酸序列。本专利技术还提供包含所述水稻基因OsGRF4启动子的生物材料。借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：(一)本专利技术首次揭示了水稻OsGRF4基因具有增强植物耐冷性的功能，OsGRF4基因对进一步阐明植物耐冷调控机理和遗传网络有着重要的意义。(二)实验表明，在冷胁迫下OsGRF4超表达转基因水稻株系的存活率显著高于野生型，可将OsGRF4基因用于植物遗传改良，以获得耐冷性增强的植物。(三)本专利技术为植物抗寒育种，特别是水稻抗寒育种提供了新的基因资源，对培育耐冷作物新品种、保障作物生产安全具有重要的应用价值。附图说明图1为本专利技术实施例1中NIL-OsGRF4与NIL-Osgrf4分别于8℃低温处理6天的耐冷表型。其中，NIL-S与NIL-L分别表示NIL-Osgrf4与NIL-OsGRF4。图2为本专利技术实施例2中超表达载体构建以及转基因单株的潮霉素PCR检测和测序分析。其中，A为超表达载体图；B为PCR扩增潮霉素基因检测转基因阳性单株；C为测序分析转基因阳性单株。图3为本专利技术实施例2中野生型水稻与OsGRF4基因超表达株系分别于8℃低温处理6天的耐冷表型。其中，WT与OX分别表示野生型与OsGRF4超表达转基因株系。图4为本专利技术实施例3中野生型水稻与OsGRF4基因干涉株系分别于8℃低温处理6天的耐冷表型。其中，WT与RNAi分别表示野生型与OsGRF4干涉转基因株系。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,MolecularCloning:aLaboratoryManual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1水稻基因OsGRF4增强植物耐冷性新功能的发现本专利技术人最先克隆了水稻穗部性状调控基因OsGRF4，http://rice.plantbiology.msu.edu/数据库编号：LOC_Os02g47280。本专利技术人在后续的研究过程中，通过查阅文献发现超表达osa-MIR396c基因可以降低水稻对盐和碱胁迫的耐受性，OsGRF4作本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.水稻基因OsGRF4在提高植物耐冷性中的应用，其特征在于，所述水稻基因OsGRF4为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：(a)由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)SEQ ID NO:3所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。
【技术特征摘要】
1.水稻基因OsGRF4在提高植物耐冷性中的应用，其特征在于，所述水稻基因OsGRF4为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：(a)由SEQIDNO:3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)SEQIDNO:3所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物包括水稻、玉米、高粱、小麦和大麦。3.一种提高植物耐冷性的方法，其特征在于，所述方法包括：1)使植物包含水稻基因OsGRF4；或2)使植物表达水稻基因OsGRF4；其中，水稻基因OsGRF4的定义同权利要求1中所述。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法包括转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法包括利用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、基因枪、电导、农杆菌介导的方法将包含水稻基因OsGRF4的重组表达...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙平勇，邓华凤，毛东海，张武汉，陈彩艳，舒服，何强，邢俊杰，彭志荣，谢芸，
申请(专利权)人：湖南杂交水稻研究中心，中国科学院亚热带农业生态研究所，
类型：发明
国别省市：湖南,43
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