基于乳液PCR的一步法将单链抗体库重排为全长抗体库的方法技术

本发明专利技术提供的一种将单链抗体库重排为全长抗体库的方法，将单链抗体模板、引物序列组、连接片段在乳液PCR条件下进行两阶段PCR扩增反应。本发明专利技术的方法能够简化操作过程，有效维持轻重链的原始配对以及原始库的多样性特征。

Single chain antibody library rearrangement into full-length antibody library based on one step method of emulsion PCR

【技术实现步骤摘要】
基于乳液PCR的一步法将单链抗体库重排为全长抗体库的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种基于乳液PCR的一步法将单链抗体库重排为全长抗体库的方法。
技术介绍
现有的噬菌体展示抗体库筛选方法得到的单链抗体通常需要重排为全长的抗体，而通常的做法是针对淘选到的单链抗体分别单独进行重排，这种方法需要繁复的工作。而且更重要的是，由于真核细胞中蛋白的折叠修饰与原核细胞中不同，大部分重排后的全长抗体会丧失或减弱其结合抗原的能力。因此，通过结合噬菌体展示与哺乳动物细胞展示来直接筛选最终的全长抗体成为一个更优的方案，而这个过程需要将单链抗体文库重排为全长抗体文库，而重排过程的关键点在于抗体轻重链原始配对的保持。现有的较为成功的单链抗体文库重排为全长抗体文库的技术是基于反向PCR的原理，将抗体轻链可变区(VL)与重链可变区(VH)保持在同一个载体上，然后将需要的其它片段通过分子克隆插入，再以其为模板进行PCR获得全长抗体序列，并进一步克隆到目的载体中。由于整个过程中没有轻重链的分离，因此可以获得维持原始轻重链配对的全长文库。但是该方法有很大局限性，比如轻重链方向只能维持为原来的方向，同时该过程由于需要进行两步PCR，以及两步分子克隆建库，复杂的过程使得原始库的多样性和特征很难维持。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于乳液PCR的一步法将单链抗体库重排为全长抗体库的方法，能够简化操作过程，有效维持轻重链的原始配对以及原始库的多样性特征。本专利技术将单链抗体库重排为全长抗体库的方法，包括将单链抗体模板、引物序列组、连接片段在乳液PCR条件下进行扩增反应的步骤；所述单链抗体模板包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)；所述引物序列组包括目的片段为重链可变区(VH)的5’端引物或引物组(VH-FW)、目的片段为重链可变区(VH)的3’端引物或引物组(JH-RV)、目的片段为轻链可变区(VL)的5’端引物或引物组(VL-FW)、目的片段为轻链可变区(VL)的3’端引物或引物组(JL-RV)；其中一个目的片段(VH或VL)的5’端引物或引物组(VH-FW或VL-FW)与另一个目的片段的3’端引物或引物组(JL-RV或JH-RV)上设有分别与所述连接片段的两端重叠延伸的重叠片段；设有重叠片段的引物或引物组数量少于未设有重叠片段的引物或引物组；未设有重叠片段的引物或引物组(一个目的片段的VL-FW或VH-FW与另一个目的片段的JH-RV或JL-RV)不能匹配单链抗体模板上同时包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的原始序列。其中，所述单链抗体模板来源于体外展示的单链抗体库，展示系统可以任选自噬菌体展示系统、核糖体或mRNA展示系统、酵母展示系统、哺乳动物细胞展示系统、细菌展示系统(如大肠杆菌外膜展示或大肠杆菌内膜展示)等，优选最为成熟的噬菌体展示系统。其中，在单链抗体模板上表达方向可以为重链可变区(VH)在前，也可以为轻链可变区(VL)在前，或者重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)头头相接或者尾尾相接；重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)中间一般连接有一段linker。本专利技术技术方法中，当单链抗体模板上表达方向为重链可变区(VH)在前、轻链可变区(VL)在后时，重排为全长抗体库后则轻链可变区(VL)在前、重链可变区(VH)在后，这是由数量相对较多的未设有重叠片段的引物或引物组不能匹配单链抗体模板上同时包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的原始序列所决定的，由于数量相对较少的设有重叠片段的引物或引物组在PCR的前期循环被耗尽，多余的未设有重叠片段的引物或引物组启动后续的PCR循环，使得重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的前后顺序交换，并以重叠延伸PCR的方式将连接片段插入重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)之间，从而形成重排后的全长抗体片段(PCR目的片段)；基于同样的原因，当单链抗体模板上表达方向为轻链可变区(VL)在前、重链可变区(VH)在后时，重排为全长抗体库后则重链可变区(VH)在前、轻链可变区(VL)在后；当重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)头头相接或者尾尾相接时，重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)任一在前均可。其中，所述引物序列组中：未设有重叠片段的引物或引物组上可设有酶切位点、蛋白标签序列、蛋白间隔或连接序列、调控序列等功能序列，可用于重排后全长抗体片段的编辑、纯化等操作。其中，所述连接片段能够使重排后全长抗体片段上的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)分离开各自表达；可以包括：i)与在前的重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)构成重链或轻链的部分或全部恒定区序列；例如当重链可变区(VH)在前时，连接片段上具有与重链可变区(VH)连接的重链恒定区(CH1-Fc)，当轻链可变区(VL)在前时，连接片段上具有与轻链可变区(VL)连接的轻链恒定区(CL)；ii)用于终止在前的重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)表达的间隔序列；例如T2A切割系统、终止子等；iii)用于引导或启动在后的轻链可变区(VL)或重链可变区(VH)表达的引导或启动序列；例如人源白介素2的信号肽(IL2SS)、启动子等。另外，所述连接片段上也可以根据需要引入酶切位点、蛋白标签序列、蛋白间隔或连接序列、调控序列等功能序列。其中，所述乳液PCR包括两阶段PCR，第一阶段PCR用于引物序列组以单链抗体为模板分别克隆重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)片段，第二阶段PCR用于克隆得到的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)片段通过重叠区域与连接片段相互搭配，在未设有重叠片段的引物或引物组启动下通过重叠延伸PCR获得重排后的全长抗体片段。设有重叠片段的引物或引物组在第一阶段PCR被耗尽，剩余的未设有重叠片段的引物或引物组不能匹配单链抗体模板上的原始序列，因此能够顺利启动重叠延伸PCR获得PCR目的片段。两阶段PCR所需的循环数、模板数量、引物数量能够等能够根据需要进行调节，这是本领域技术人员能够实现的。两阶段PCR的循环数量比优选为1：(3-6)；设有重叠片段的引物或引物组与未设有重叠片段的引物或引物组优选的浓度比为1：(10-40)。其中，重排后的全长抗体片段(PCR目的片段)能够进一步被连接构建到表达载体上进行表达，表达载体可以预先被改造为包括：i)用于引导或启动在前的轻链可变区(VL)或重链可变区(VH)表达的引导或启动序列；例如人源白介素2的信号肽(IL2SS)、启动子等；ii)与在后的重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)构成重链或轻链的部分或全部恒定区序列；例如当重链可变区(VH)在后时，表达载体上具有与重链可变区(VH)连接的重链恒定区(CH1-Fc)，当轻链可变区(VL)在后时，表达载体上具有与轻链可变区(VL)连接的轻链恒定区(CL)。单链抗体库重排过程中，所述单链抗体模板能够独立分散于单个的乳液微滴中，由于通过控制模板数量能够使得单个乳液微滴中仅有一个单链抗体模板，两阶段PCR能够排除模板之间的相互干扰，有效保证了单链抗体序列轻重链配对的原始性，含有单链抗体的乳液微滴中仅含有一个单链抗体模板的理论数可达约90％，因此重排为全长抗体库的产物中正确率可达90％左右。本专利技术的技术方法相对于现有的方法步本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种将单链抗体库重排为全长抗体库的方法，包括将单链抗体模板、引物序列组、连接片段在乳液PCR条件下进行扩增反应的步骤；所述单链抗体模板包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)；所述引物序列组包括目的片段为重链可变区(VH)的5’端引物或引物组(VH‑FW)、目的片段为重链可变区(VH)的3’端引物或引物组(JH‑RV)、目的片段为轻链可变区(VL)的5’端引物或引物组(VL‑FW)、目的片段为轻链可变区(VL)的3’端引物或引物组(JL‑RV)；其中一个目的片段(VH或VL)的5’端引物或引物组(VH‑FW或VL‑FW)与另一个目的片段的3’端引物或引物组(JL‑RV或JH‑RV)上设有分别与所述连接片段的两端重叠延伸的重叠片段；设有重叠片段的引物或引物组数量少于未设有重叠片段的引物或引物组；未设有重叠片段的引物或引物组不能匹配单链抗体模板上同时包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的原始序列。

【技术特征摘要】
1.一种将单链抗体库重排为全长抗体库的方法，包括将单链抗体模板、引物序列组、连接片段在乳液PCR条件下进行扩增反应的步骤；所述单链抗体模板包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)；所述引物序列组包括目的片段为重链可变区(VH)的5’端引物或引物组(VH-FW)、目的片段为重链可变区(VH)的3’端引物或引物组(JH-RV)、目的片段为轻链可变区(VL)的5’端引物或引物组(VL-FW)、目的片段为轻链可变区(VL)的3’端引物或引物组(JL-RV)；其中一个目的片段(VH或VL)的5’端引物或引物组(VH-FW或VL-FW)与另一个目的片段的3’端引物或引物组(JL-RV或JH-RV)上设有分别与所述连接片段的两端重叠延伸的重叠片段；设有重叠片段的引物或引物组数量少于未设有重叠片段的引物或引物组；未设有重叠片段的引物或引物组不能匹配单链抗体模板上同时包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的原始序列。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单链抗体模板来源于体外展示的单链抗体库，展示系统任选自噬菌体展示系统、核糖体或mRNA展示系统、酵母展示系统、哺乳动物细胞展示系统、细菌展示系统，优选为噬菌体展示系统。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在单链抗体模板上表达方向为重链可变区(VH)在前，或者为轻链可变区(VL)在前，或者重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)头头相接或者尾尾相接；重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)中间一般连接有一段linker。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述引物序列组中：未设有重叠片段的引物或引物组上设有酶切位点、蛋白标签序列、蛋白间隔或连接序列、调控序列的功能序列。5.根据权利要求1所述的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：张宏恺，刘耀辉，王媛，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津,12