一种复制可控型流感病毒的检测方法技术

本发明专利技术涉及一种复制可控型流感病毒的检测方法。待检测的病毒通过病毒拯救的方式获得，在稳定整合并表达流感病毒PA、PB1、PB2和NP基因的细胞株中引入复制可控的流感病毒拯救系统，该系统包含在PA、PB1、PB2和NP基因中分别引入了终止密码子的质粒。该检测方法的特点在于通过生产用细胞实现病毒复制增殖，再通过qPCR方法测量并代入根据野生型病毒测量获得的Ct值曲线获得病毒量。该检测方法具有较强的特异性、较好的重复性和较高的精密度。

A Detection Method for Replicating Controllable Influenza Virus

【技术实现步骤摘要】
一种复制可控型流感病毒的检测方法
本专利技术涉及流感病毒
，具体涉及一种复制可控型流感病毒的检测方法。
技术介绍
流行性感冒(流感)是由流感病毒(Influenzavirus)导致的呼吸道和其他脏器的疾病，在健康儿童和成人中，每年均会在春冬季，甚至其它季节有不同程度的流行，通常是一种急性、传染性的疾病。流感病毒是导致流感的病原体，属于负链单股RNA病毒，其基因组共有8个独立的RNA片段(分别以片段1-8命名)组成，核酸总长度约为13.6kb。这8个片段共编码10种蛋白质，其中8种为结构蛋白，包括PB1、PB2、PA、HA、NA、NP、M1、M2,而NS1、NS2为非结构蛋白。流感病毒分为人流感病毒和动物流感病毒，人流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型。病毒复制主要依靠病毒核糖核蛋白(vRNPs)。甲型流感病毒的核糖核蛋白由病毒RNA、RNA聚合酶(RdRp)复合体以及核蛋白(NP)组成，是病毒的最小复制单位，病毒蛋白在该结构基础上才能表达。vRNPs结构中的RdRp由3个亚基(PA、PB2、PB1)组成，PB1位于三聚体的核心，其N末端和C末端分别与PA亚基的C末端以及PB2亚基的N末端通过非共价键(如疏水作用、氢键、范德华力等)形成稳定的蛋白质复合物。尽管治疗流感病毒可以使用各类抗病毒药物，但由于流感病毒快速变异，世界各地每年有流感的散发流行和暴发，正确接种流感疫苗可以有效的减少流感发病率。目前，流感疫苗按照其种类可分为：全病毒灭活疫苗、裂解疫苗和亚单位疫苗。全病毒灭活疫苗、裂解疫苗，因流感快速变异，需要每年在爆发季节前，对当年可能爆发的毒株进行预测，准确预测有一定难度，预测错误，将导致疫苗保护率大幅度下降，而且，即便准确预测，也因为目前主要采用的鸡胚生产工艺，病毒产生的鸡胚适应性变异，导致疫苗保护效率不高；对于亚单位疫苗，由于目前并没有发现流感病毒可以用于疫苗的保守序列，导致进展缓慢。因此，迫切需要更具有安全性并更好的保留全病毒免疫活性的流感疫苗及其生产方法的问世。在此基础上，也需要一种专门针对复制可控型流感病毒的检测方法，实现在疫苗生产以及疫苗使用过程中流感病毒有效性和安全性的控制。
技术实现思路
本专利技术的目的在于通过特定哺乳动物细胞生产流感病毒，以用于疫苗制备，并通过特定检测方法实现对所述流感病毒的检测。所述流感病毒由于引入突变而不能在正常哺乳动物细胞中增殖，只能在整合了外源病毒蛋白基因的宿主细胞中增殖。为达到上述目的，本专利技术向哺乳动物细胞中转入特定的基因，获得稳定表达相应的流感病毒蛋白的宿主细胞，再转染相关基因突变后的流感病毒拯救系统，拯救获得复制可控的新型流感活病毒。为实现该类特殊病毒的检测，本专利技术利用qPCR方法针对所述病毒基因组的特点设计相应引物，以实现快速准确的检测。具体而言，本专利技术提供如下技术方案：首先，本专利技术提供一种复制可控型流感病毒的定量检测方法，将待测病毒液与生产用细胞共培养，随后提取总RNA并逆转录为cDNA，最后根据已知拷贝数的野生型病毒qPCR的Ct值结果绘制标准曲线，代入复制可控型流感病毒的Ct值，计算获得流感病毒拷贝数优选的，野生型病毒为流感病毒H1N1的A/WSN/1933株，且检测野生型病毒和复制可控型流感病毒的qPCR引物均为下列引物:Ben3-FP：5’-CAAATGTCCAAAGAAGTAAATGCTAGA-3’(SEQIDNO:23)Ben3-RP：5’-GGCATCCATCAGCAGGAATT-3’(SEQIDNO:24)。在一个优选方案中，所述检测方法包括如下步骤：(1)用DMEM+10％FBS培养基于37℃，5％CO2静置培养293T细胞或Vero细胞24小时；(2)加入待测病毒液并于37℃，5％CO2静置孵育2小时；(3)TRNzol法提取RNA；(4)将RNA反转录为cDNA(5)通过qPCR反应体系测量待测样品的Ct值，根据已知拷贝数的野生型病毒作为标准品进行qPCR并绘制标准曲线，将待测样品的Ct值带入回归曲线并获得相应拷贝数；所述Ct值为每个反应管内的荧光信号到达设定值时所经历的循环数。优选的，步骤(4)按如下方案进行：(i)配制含有随机引物和寡核苷酸引物以及待测RNA的反应体系1，以及含有MgCl2、缓冲液、dNTP、重组RNA酶抑制剂以及AMV逆转录酶的反应体系2；(ii)将反应体系1离心于管底，在常规PCR仪上70℃孵育5min，完成后立即置于冰上3min；(iii)将反应体系2加入到反应体系1中，25℃孵育5min，42℃孵育50min，70℃孵育15min，4℃备用。本专利技术的病毒检测方法优选适用于按照本专利技术的特定方法获得的复制可控型流感病毒。具体而言，所述病毒具有如下特点：通过将病毒拯救系统导入哺乳动物宿主细胞的方式获得，所述哺乳动物宿主细胞稳定整合流感病毒PA、PB1、PB2和NP基因，流感病毒拯救系统中携带突变型PA、PB1、PB2和NP基因，所述突变使得流感病毒拯救系统不能在天然哺乳动物细胞中拯救获得完整病毒。优选的，所述流感病毒拯救系统包括编码突变型PA、PB1、PB2和NP基因的重组质粒以及编码HA、NA、M、NS四种基因的重组质粒，所述突变通过分别在四个基因序列中引入TAG密码子实现。更优选的，所述所述稳定整合到宿主细胞的PA、PB1、PB2和NP基因以及流感病毒拯救系统中的病毒编码基因HA、NA、M、NS均来自流感病毒H1N1的A/WSN/1933株。尤其优选的，所述所述稳定整合到宿主细胞的PA、PB1、PB2和NP基因的核苷酸序列分别为如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。最为优选的，所述流感病毒拯救系统包括如下八个质粒：pPolI-WSN-PB、pPolI-WSN-PB1、pPolI-WSN-PA、pPolI-WSN-NP、pPolI-WSN-HA；pPolI-WSN-NA；pPolI-WSN-M；pPolI-WSN-NS，其中，所含有的PA基因存在R266密码子突变为TAG、PB1基因存在R52密码子突变为TAG)、PB2基因存在K33密码子突变为TAG和NP基因存在D101密码子突变为TAG。以下对相关术语进行进一步解释。病毒拯救病毒拯救或称病毒的感染性分子克隆属于反向遗传操作技术，即通过人工操作基因，用病毒核酸的适当形式在一定条件下转染细胞，产生有感染性的病毒粒子。本专利技术可选的使用Hoffmann等建立的8质粒拯救系统，完全以质粒为基础的系统其优点是不需要辅助病毒，避免了大量的筛选工作。8质粒系统以数量最少的质粒为基础，利用同一载体实现在细胞内的病毒RNA和蛋白合成，进而包装成病毒。在本专利技术中，病毒拯救获得病毒颗粒可按如下方法进行：(1)构建编码PA、PB1、PB2和NP基因的单质粒或多质粒系统；(2)将步骤(1)的单质粒或多质粒系统导入哺乳动物细胞，筛选稳定表达四种基因的宿主细胞，优选地，通过电转化导入；(3)分别构建包含突变型PA、PB1、PB2和NP基因的重组质粒以及编码HA、NA、M、NS四种基因的重组质粒，形成流感病毒拯救系统，所述突变通过分别在四个基因序列中引入TAG密码子实现；(4)将步骤(3)构建的病毒拯救系统共转染导入步本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种复制可控型流感病毒的定量检测方法，其特征在于：将待测病毒液与生产用细胞共培养，随后提取总RNA并逆转录为cDNA，最后根据已知拷贝数的野生型病毒qPCR的Ct值结果绘制标准曲线，代入复制可控型流感病毒的Ct值，计算获得流感病毒拷贝数。

【技术特征摘要】
1.一种复制可控型流感病毒的定量检测方法，其特征在于：将待测病毒液与生产用细胞共培养，随后提取总RNA并逆转录为cDNA，最后根据已知拷贝数的野生型病毒qPCR的Ct值结果绘制标准曲线，代入复制可控型流感病毒的Ct值，计算获得流感病毒拷贝数。2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于野生型病毒为流感病毒H1N1的A/WSN/1933株，且检测野生型病毒和复制可控型流感病毒的qPCR引物均为下列引物:Ben3-FP：5’-CAAATGTCCAAAGAAGTAAATGCTAGA-3’(SEQIDNO:23)；Ben3-RP：5’-GGCATCCATCAGCAGGAATT-3’(SEQIDNO:24)。3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)用DMEM+10％FBS培养基于33-38℃，5％CO2静置培养293T细胞或Vero细胞24小时；(2)加入待测病毒液并于33-38℃，5％CO2静置孵育2小时；(3)TRNzol法提取RNA；(4)将RNA反转录为cDNA；(5)通过qPCR反应体系测量待测样品的Ct值，根据已知拷贝数的野生型病毒作为标准品进行qPCR并绘制标准曲线，将待测样品的Ct值带入回归曲线并获得相应拷贝数；所述Ct值为每个反应管内的荧光信号到达设定值时所经历的循环数。4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤(4)按如下方案进行：(i)配制含有随机引物和寡核苷酸引物以及待测RNA的反应体系1，以及含有MgCl2、缓冲液、dNTP、重组RNA酶抑制剂以及AMV逆转录酶的反应体系2；(ii)将反应体系1离心于管底，在常规PCR仪上70℃孵育5min，完成后立即置于冰上3min；(iii)将反应体系2加入到反应体系1...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴东升，张文捷，李会强，周德敏，马闻箫，
申请(专利权)人：浙江森卫生物医药发展有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33