一种禽滑液囊支原体的聚合酶螺旋扩增检测引物组和试剂盒制造技术

本发明专利技术属于动物病原检测技术领域，具体涉及一种禽滑液囊支原体的聚合酶螺旋扩增检测引物组和试剂盒。为快速诊断和检测滑液囊支原体，本发明专利技术根据其vlhA基因保守区设计合成特异性PSR引物，包括上游引物S1和下游引物S2，并通过反应温度和时间的优化，建立了聚合酶螺旋扩增检测方法。检测试剂包括如下组分反应缓冲液、dNTPs、MgSO4、Bst DNA聚合酶、去离子水、显色试剂和上述引物。本发明专利技术提供的检测试剂在应用时具有灵敏特异、简便快捷等优点，可用于MS的检测和临床诊断。

A primer group and kit for detection of Mycoplasma synovialis by polymerase helical amplification

【技术实现步骤摘要】
一种禽滑液囊支原体的聚合酶螺旋扩增检测引物组和试剂盒
本专利技术属于动物病原检测
，具体涉及一种滑禽液囊支原体的聚合酶螺旋扩增检测引物组和试剂盒。
技术介绍
滑液囊支原体(Mycoplasmasynoviae)属软膜体纲，支原体目，支原体科，支原体属，是一种介于细菌和病毒之间的没有细胞壁的原核微生物。在高倍镜观察下，菌体为多形态的球状体；采用姬姆萨和瑞氏染色，电镜观察菌体细胞呈圆形或者梨形，内无核糖体，无细胞壁，外包三层膜；在Frey氏固体培养基上培养时，可在低倍镜下观察到菌落呈“煎饼”状。MS的自然宿主是鸡和火鸡，主要引发关节炎、腱鞘炎，部分菌群可引起严重气囊炎。在感染初期，常可观察到鸡冠苍白，跛足、采食量下降和生长迟缓等，随着病情加重，会出现羽毛凌乱、鸡冠萎缩，大部分鸡关节、爪垫肿胀，泄殖腔排出含有大量尿酸盐的浅绿色排泄物；解剖可观察到，在关节处有黄色粘液和干酪物积累，胸骨粘膜肿大及脚垫肿，胸腹气囊膜明显增厚。此外，Ruben等曾从家禽的大脑中分离出MS，造成脑膜血管炎和脑膜炎；需要引起重视的是，部分感染MS的鸡群也会引起呼吸道疾病，主要表现为亚临床症状，如果伴有其他呼吸道疾病，如传染性支气管炎病毒(IBV)、新城疫病毒(NDV)等，呼吸症状会更明显；因此在感染早期很容易引起误诊。商品肉鸡感染MS后，会导致饲料利用率下降，从而引发增长缓慢和生长周期变长。蛋鸡和种鸡感染后，会出现蛋品质和产蛋量下降，主要表现为蛋壳顶端异性(EAA，EggshellApexAbnormality)、变薄和易碎，由此造成严重的经济损失。2011年，Gole等对澳大利亚昆士兰地区的部分蛋鸡群进行ELISA实验，证实鸡群血清阳性率高达69％。Moreira等对在2008年到2012年葡萄牙36个商品蛋鸡群进行ELISA和PCR检测，阳性率分别为66.7％和95％，结合综合症状临床评估MS患病率为40.3％。2010～2015年Xue等对中国部分鸡群进行血清学检测，研究表明中国的21个省份的44395份未免疫的鸡群中，阳性率达到41.19％；不同养殖场的阳性率在24.70～57.20％之间；各省份中阳性率最低为5.10％。支原体的分离不如培养细菌简单，由于缺乏细胞壁，对生长环境要求苛刻，不适合快速鉴定。血清检测不适用于多早期检测，而且由于疫苗的广泛应用，使疫苗株与野生株难以区分，容易产生假阳性。相比之下，分子生物学检测更方便、更灵敏、更具体，但分子检测需要更多的仪器。KursaO使用环介导的等温扩增法快速检测MS，LAMP需要4或6个引物，一旦发生碱基突变，扩增可能因失配而失败。2015年，刘威专利技术了聚合酶螺旋反应PSR的新方法。利用混合引物，利用BST-DNA聚合酶及其扩增系统的链置换活性，在恒温条件下对核酸进行扩增。与LAMP或PCR相比，PSR在恒温条件下只需要一对引物进行扩增。由于产品会引起溶液酸碱度的变化，因此添加酚红指示剂可根据颜色变化观察结果，PSR技术在人畜疾病诊断中的应用具有重要意义。
技术实现思路
为克服普通检测效率低、难操作、成本高的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种禽滑液囊支原体的聚合酶螺旋扩增检测引物组和试剂盒，应用该试剂盒进行检测时，检测时间短，特异性和敏感性高，操作方便且成本低。本专利技术的第一个目的是提供用于检测禽滑液囊支原体的聚合酶螺旋扩增引物组，所述引物组由以下引物组成：上游引物S1：acgaattcgtacatagaagtatag-GTGATCAAACTCCRGACCTGC；下游引物S2：gatatgaagatacatgcttaagca-ACCTGGGTTTTCTGGGTTTCCT。本专利技术的第二个目的是提供一种禽滑液囊支原体的聚合酶螺旋扩增检测试剂，所述试剂包括权利要求1所述的引物组。作为优选，所述试剂还包括如下组分：10×反应缓冲液、dNTPs、Mg2+、BstDNA聚合酶、去离子水、模板DNA和显色试剂。作为优选，所述试剂中Mg2+的浓度为6mM。作为优选，所述试剂中dNTPs的浓度为1.5mM；作为优选，所述试剂中显色试剂为0.025mM酚红和0.08mM甲酚红混合指示剂。作为优选，所述试剂还包括阳性对照。本专利技术的第三个目的是提供一种禽滑液囊支原体的聚合酶螺旋扩增检测试剂盒，所述试剂盒包括权利要求2-6任一项所述的聚合酶螺旋扩增检测试剂。本专利技术的第四个目的是提供上述的检测试剂或检测试剂盒在如下任一中的应用：(1)不以疾病的诊断和治疗为目的的检测或辅助检测禽滑液囊支原体；(2)制备用于检测或辅助检测禽滑液囊支原体的产品；(3)不以疾病的诊断和治疗为目的的检测或辅助检测待测动物样品是否感染禽滑液囊支原体；(4)制备用于检测或辅助检测待测动物样品是否感染禽滑液囊支原体的产品；(5)不以疾病的诊断和治疗为目的的检测待测病毒是否为禽滑液囊支原体；(6)制备用于检测或辅助检测待测病毒是否为禽滑液囊支原体的产品。本专利技术的第五个目的是提供一种检测或辅助检测待测动物样品是否感染禽滑液囊支原体的方法，该方法不以疾病的诊断和治疗为目的，包括以下步骤：(1)从待测动物样品中提取基因组DNA作为模板，采用权利要求2-6任一项所述的检测试剂或权利要求7所述的检测试剂盒进行聚合酶螺旋扩增，得到扩增产物；作为优选，所述聚合酶螺旋扩增的反应条件为恒温63℃作用40min；(2)按照下述任一方法确定待测动物样品是否感染禽滑液囊支原体：A、扩增产物呈现橙黄色则待测动物样品感染禽滑液囊支原体；扩增产物呈现紫红色则待测动物样品未感染禽滑液囊支原体；B、将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条带呈梯状分布，则待测动物样品感染禽滑液囊支原体；仅有一条引物条带，则待测动物样品未感染禽滑液囊支原体。本专利技术的第六个目的是提供一种检测或辅助检测待测病原为禽滑液囊支原体的方法，该方法不以疾病的诊断和治疗为目的，包括以下步骤：(1)从待测材料中提取基因组DNA作为模板，采用权利要求2-6任一项所述的检测试剂或权利要求7所述的检测试剂盒进行聚合酶螺旋扩增，得到扩增产物；作为优选，所述聚合酶螺旋扩增的反应条件为恒温63℃作用40min；(2)按照下述任一方法确定待测病原是否为禽滑液囊支原体：A、扩增产物呈现橙黄色则待测病原是禽滑液囊支原体；扩增产物呈现紫红色则待测病原不是禽滑液囊支原体；B、将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条带呈梯状分布，则待测动物病原是禽滑液囊支原体；仅有一条引物条带，则待测病原不是禽滑液囊支原体。本专利技术的有益效果如下：本专利技术检测禽滑液囊支原体的聚合酶螺旋试剂盒具有高灵敏性：将MS的vlhA质粒标准DNA进行10倍梯度稀释后作为PSR反应模板，以同样的模板浓度用PCR方法进行检测，结果表明：PSR方法比常规PCR扩增的方法至少高100倍。由此可见，本专利技术PSR方法具有更高的灵敏度。本专利技术检测禽滑液囊支原体的聚合酶螺旋试剂盒具有高特异性：将临床上常见的禽类病毒性疾病：滑液囊支原体(MS)、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、禽H9亚型流感(AIV)、MS-H(弱毒活疫苗)、鸡毒支原体(MG)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)分别作为检测对象，用本专利技术的方法进行检测，仅MS为阳性，表明该方法具有高特异性。本专利技术检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测禽滑液囊支原体的聚合酶螺旋扩增引物组，其特征在于：所述引物组由以下引物组成：上游引物S1：acgaattcgtacatagaagtatag‑GTGATCAAACTCCRGACCTGC；下游引物S2：gatatgaagatacatgcttaagca‑ACCTGGGTTTTCTGGGTTTCCT。

【技术特征摘要】
1.用于检测禽滑液囊支原体的聚合酶螺旋扩增引物组，其特征在于：所述引物组由以下引物组成：上游引物S1：acgaattcgtacatagaagtatag-GTGATCAAACTCCRGACCTGC；下游引物S2：gatatgaagatacatgcttaagca-ACCTGGGTTTTCTGGGTTTCCT。2.一种禽滑液囊支原体的聚合酶螺旋扩增检测试剂，其特征在于：所述试剂包括权利要求1所述的引物组。3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于：所述试剂还包括如下组分：10×反应缓冲液、dNTPs、Mg2+、BstDNA聚合酶、去离子水、模板DNA和显色试剂。4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于：所述试剂中Mg2+的浓度为6mM。5.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于：所述试剂中dNTPs的浓度为1.5mM；作为优选，所述试剂中显色试剂为0.025mM酚红和0.08mM甲酚红混合指示剂。6.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于：所述试剂还包括阳性对照。7.一种禽滑液囊支原体的聚合酶螺旋扩增检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求2-6任一项所述的聚合酶螺旋扩增检测试剂。8.权利要求2-6任一项所述的检测试剂或权利要求7所述的检测试剂盒在如下任一中的应用：(1)不以疾病的诊断和治疗为目的的检测或辅助检测禽滑液囊支原体；(2)制备用于检测或辅助检测禽滑液囊支原体的产品；(3)不以疾病的诊断和治疗为目的的检测或辅助检测待测动物样品是否感染禽滑液囊支原体；(4)制备用于检测或辅助检测待测动物样品是否感染禽滑液囊支原体的产品；(5)不以疾病的诊断和治疗...

【专利技术属性】
技术研发人员：冀君，吴倩倩，李宛玉，许鑫，姚伦广，
申请(专利权)人：南阳师范学院，
类型：发明
国别省市：河南,41