靶向CD19且高水平稳定表达CD40抗体的CAR-T细胞及其用途制造技术

本发明专利技术涉及靶向CD19且高水平稳定表达CD40抗体的CAR‑T细胞及其用途。本发明专利技术的CAR‑T细胞含有识别CD19的嵌合抗原受体的编码序列和CD40激活性抗体的编码序列；和/或表达识别CD19的嵌合抗原受体和CD40激活性抗体。本发明专利技术人在CD19CAR‑T细胞上表达CD40抗体，该抗体与CD40抗原结合后可启动共刺激信号，促进CAR‑T细胞在体内的活化和增殖，增加细胞毒性T细胞的抗肿瘤杀伤效应，从而提高特异性杀伤肿瘤的疗效。

CAR-T cells targeting CD19 and stably expressing CD40 antibody at high level and their use

【技术实现步骤摘要】
靶向CD19且高水平稳定表达CD40抗体的CAR-T细胞及其用途
本专利技术属于基因工程学和免疫学，涉及靶向CD19且高水平稳定表达CD40抗体的CAR-T细胞及其用途。
技术介绍
肿瘤免疫疗法是当前肿瘤治疗领域中最具前景的研究方向之一，《science》杂志将肿瘤免疫疗法评为2013年十大科学突破第一位。肿瘤免疫疗法类目繁多，迄今为止，最热门、疗效最佳、最具潜力攻克肿瘤顽疾的免疫治疗法为嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)。诺华的Kymriah和Kite的Yescarta两款CAR-T产品已经获批上市。嵌合型抗原受体(CAR)是一种人工合成受体，它通常包含胞外抗原结合域、跨膜铰链区和胞内信号转导区。通过将识别肿瘤相关抗原(tumorassociatedantigen，TAA)的抗体单链可变区(scFv)和胞内信号域“免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptortyrosine-basedactivationmotifs，ITAM)”在体外进行基因重组，生成重组质粒。再将这种质粒通过基因转导的方法转入T细胞中，这样经过基因改造的T细胞称之为CAR-T细胞。CAR-T细胞在体外经大规模扩增后，回输到患者体内，能够以非MHC限制性的模式表现强效的抗癌作用。恶性淋巴瘤分为霍奇金淋巴瘤(HL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)两大类。霍奇金淋巴瘤占淋巴瘤的10％-15％，而非霍奇金淋巴瘤是发病患者增加最快的恶性肿瘤。据WHO统计，目前全球每年约有35万新发NHL，死亡人数超过20万。在霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤两大类中均可见B细胞淋巴瘤。目前淋巴瘤临床治疗药物包括糖皮质激素和烷化剂等细胞毒药物及基于特定分子靶标的靶向药物(如利妥昔单抗等)，其中基于靶向药物的联合化疗显著提高部分淋巴瘤患者临床缓解率和治愈率。但目前仍有相当一部分淋巴瘤患者对现有治疗方案不敏感或疗效欠佳而成为“真正”难治性患者。一些新型治疗手段(如细胞免疫治疗等)使部分复发或难治性淋巴瘤患者获得缓解并延长其生存期。目前正在开发的针对血液系统恶性肿瘤的CAR-T的种类很多，主要包括利用抗CD19、抗CD20、抗Kappa轻链、抗CD22、抗CD23、抗CD30、抗CD70等抗体构建CAR修饰的T细胞进行抗肿瘤研究，其中以抗CD19、抗CD20单克隆抗体最为热门。选择合适的肿瘤抗原作为靶标是设计安全有效CAR-T的关键。由于CD19仅表达于各分化阶段的正常及恶性B细胞而不表达于其他非B细胞(如造血干细胞等)表面，是治疗B系肿瘤很有潜力的靶点，也是CAR-T研究中的热点，因而CD19CAR-T被广泛用于急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)、慢性B淋巴细胞白血病(B-CLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、NHL和多发性骨髓瘤(MM)等恶性B细胞淋巴瘤的临床试验。CD40抗原是属于TNFR超家族的细胞表面分子,是一种I型跨膜糖蛋白，分子量为48KD，广泛表达于T细胞，抗原递呈细胞、造血细胞、粒细胞等。CD40L是Ⅱ型跨膜糖蛋白，属于TNF超家族，主要表达于CD4+辅助性T细胞(Th细胞)。CD40-CD40L是免疫应答中一对极其重要的共刺激分子，具有广泛的生物学效应。CD40-CD40L相互作用传递信号，引起IL-12水平上调，活化DC细胞，增强APC对抗原的递呈能力，同时，CD40-CD40L还可以促进T细胞分泌大量的细胞因子，如GM-CSF,IL-4,TNF-a，IFN-γ，从而增强CD8+T细胞的CTL效应，增强对肿瘤的杀伤效应。哈德斯菲尔德大学的研究人员开发了一种利用CD40进行靶向治疗的方法，他们用CD40的配体来将其激活，再通过静脉注射进行靶向治疗。哈德斯菲尔德大学对该方法进行了专利申请，(Oncogene,2017May4；36(18):2515-2528)。美国生物药研发公司Apexigen开发的APX005M(NCT02482168)，对非小细胞癌，黑色素瘤，尿路上皮癌，高频微卫星不稳定性(MSI-H)，头颈癌等有良好的抑制效果。
技术实现思路
本专利技术提供一种T细胞，所述T细胞自表达CD40激活性抗体并靶向CD19。在一个或多个实施方案中，所述T细胞的基因组中整合了CD40激活性抗体的表达框以及识别CD19的嵌合抗原受体的表达框。在一个或多个实施方案中，所述CD40激活性抗体的氨基酸序列如SEQIDNO:2第21-497位氨基酸残基所示，或如SEQIDNO:2所示。在一个或多个实施方案中，所述CD40激活性抗体的编码序列如SEQIDNO:4第61-1491位碱基序列所示，或如SEQIDNO:4所示。在一个或多个实施方案中，所述识别CD19的嵌合抗原受体从N端到C端依次含有任选的信号肽、抗CD19单链抗体、铰链区、跨膜区、胞内共刺激信号域和胞内信号域。在一个或多个实施方案中，所述信号肽为CD8信号肽、CD28信号肽、CD4信号肽或轻链信号肽；更优选地为CD8信号肽；优选地，所述CD8信号肽的氨基酸序列如SEQIDNO:1第1-21位氨基酸残基所示。在一个或多个实施方案中，所述scFv的氨基酸序列如SEQIDNO:1第22-263位氨基酸残基所示。在一个或多个实施方案中，所述铰链区选自CD8的胞外铰链区、IgG1FcCH2CH3铰链区、IgD铰链区、CD28的胞外铰链区、IgG4FcCH2CH3铰链区和CD4的胞外铰链区；优选为CD8α铰链区或IgG4CH2CH3铰链区；优选地，所述CD8α铰链区的氨基酸序列如SEQIDNO:1第274-308氨基酸残基所示。在一个或多个实施方案中，所述跨膜区为CD28跨膜区、CD8跨膜区、CD3ζ跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区和DAP10跨膜区中的一种；优选为CD8跨膜区，优选其氨基酸序列如SEQIDNO:1第309-332位氨基酸残基所示。在一个或多个实施方案中，所述胞内共刺激信号域包括共刺激信号分子的胞内结构域，包括CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶、诱导性T细胞共刺激因子(ICOS)和DNAX激活蛋白10的胞内结构域；优选地，所述胞内共刺激信号域为CD137/4-1BB的胞内结构域；优选地，所述CD137/4-1BB的氨基酸序列如SEQIDNO:1第333-374位氨基酸残基所示。在一个或多个实施方案中，所述胞内信号域为CD3ζ胞内信号域或FcεRIγ胞内信号域；优选为CD3ζ胞内信号域，优选地所述CD3ζ胞内信号域的氨基酸序列如SEQIDNO:1第375-486位氨基酸残基所示。在一个或多个实施方案中，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQIDNO:1第22-486位氨基酸残基所示，或如SEQIDNO:1所示；优选地，所述嵌合抗原受体的编码序列如SEQIDNO:3第64-1458位碱基所示，或如SEQIDNO:3所示。本专利技术还提供一种组合物，所述组合物含有：含本专利技术所述嵌合抗原受体的表达框的载体，所述载体用于将所述表达框整合到宿主细胞的基因组中；和含CD40激活性抗体的表达框的载体，所述载体用于将所述表达框整合到宿主细胞的基因组中。在一个或多个实施方案中，所述CD40激活性抗体的氨基酸序列如SEQIDNO:2第21-497位氨本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种T细胞，所述T细胞自表达CD40激活性抗体并靶向CD19；优选地，所述T细胞：(1)含有识别CD19的嵌合抗原受体的编码序列和CD40激活性抗体的编码序列；和/或(2)表达识别CD19的嵌合抗原受体和CD40激活性抗体；优选地，所述T细胞的基因组中整合了CD40激活性抗体的表达框以及识别CD19的嵌合抗原受体的表达框。

【技术特征摘要】
1.一种T细胞，所述T细胞自表达CD40激活性抗体并靶向CD19；优选地，所述T细胞：(1)含有识别CD19的嵌合抗原受体的编码序列和CD40激活性抗体的编码序列；和/或(2)表达识别CD19的嵌合抗原受体和CD40激活性抗体；优选地，所述T细胞的基因组中整合了CD40激活性抗体的表达框以及识别CD19的嵌合抗原受体的表达框。2.如权利要求1所述的T细胞，其特征在于，所述识别CD19的嵌合抗原受体从N端到C端依次含有任选的信号肽、抗CD19单链抗体、铰链区、跨膜区、胞内共刺激信号域和胞内信号域。3.如权利要求2所述的T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体具有以下一项或多项特征：所述信号肽为CD8信号肽、CD28信号肽或CD4信号肽；优选地为CD8信号肽；优选地，所述CD8信号肽的氨基酸序列如SEQIDNO:1第1-21位氨基酸残基所示；所述单链抗体的氨基酸序列如SEQIDNO:1第22-263位氨基酸残基所示；所述铰链区选自CD8的胞外铰链区、IgG1FcCH2CH3铰链区、IgD铰链区、CD28胞外铰链区、IgG4FcCH2CH3铰链区和CD4的胞外铰链区；优选为CD8α铰链区或IgG4CH2CH3铰链区；优选地，所述CD8α铰链区的氨基酸序列如SEQIDNO:1第264-308氨基酸残基所示；所述跨膜区选自CD28跨膜区、CD8跨膜区、CD3ζ跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区和DAP10跨膜区；优选为CD8跨膜区，优选其氨基酸序列如SEQIDNO:1第309-332位氨基酸残基所示；所述胞内共刺激信号域选自CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶、诱导性T细胞共刺激因子(ICOS)和DNAX激活蛋白10的胞内结构域；优选地，所述胞内共刺激信号域为CD137/4-1BB的胞内结构域；优选地，所述CD137/4-1BB的氨基酸序列如SEQIDNO:1第333-374位氨基酸残基所示；和所述胞内信号域为CD3ζ胞内信号域或FcεRIγ胞内信号域；优选为CD3ζ胞内信号域，优选地所述CD3ζ胞内信号域的氨基酸序列如SEQIDNO:1第375-486位氨基酸残基所示。4.如权利要求2或3所述的T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体具有以下一项或多项特征：信号肽的编码序列如SEQIDNO:3第1-63位碱基所示；抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱其军，金华君，唐熙，何周，刘祥箴，李林芳，崔连振，
申请(专利权)人：上海细胞治疗研究院，上海细胞治疗集团有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31