适用于PacBio测序平台的海洋动物与软体动物的建库测序方法技术

本发明专利技术涉及高通量测序文库构建领域，具体涉及一种适用于PacBio测序平台的海洋动物与软体动物的建库测序方法，包括如下步骤：1)对打断的DNA大片段进行切胶纯化；2)对纯化的DNA大片段进行核酸外切酶VII消化；3)对核酸外切酶VII消化产物进行第一次DNA损伤修复；4)对第一次DNA损伤修复的产物进行末端修复处理和加接头处理；5)对加接头的产物进行外切酶ExoIII和ExoVII双酶切处理；6)对外切酶ExoIII和ExoVII双酶切处理的产物进行二次筛选目的片段；7)对二次筛选产物进行第二次DNA损伤修复，即获得适用于Pacbio平台的DNA大片段文库；8)文库质检；9)上机测序。该方法可有效去除海洋软体动物体内所含杂质，可以显著提高PacBio测序聚合酶读长和数据产量。

A Sequencing Method for Marine Animals and Molluscs Based on PacBio Sequencing Platform

【技术实现步骤摘要】
适用于PacBio测序平台的海洋动物与软体动物的建库测序方法
本专利技术涉及高通量测序文库构建领域，更具体地，涉及一种适用于PacBio测序平台的海洋动物与软体动物的建库测序方法。
技术介绍
PacBio平台(PacBio核酸测序平台)采用的是单分子实时测序(SingleMoleculeReal-Time)。PacBio平台的测序基于两个关键技术，第一，PacificBiosciences公司专利技术的一种直径只有几十纳米的纳米孔，该纳米孔内只能容许单分子核酸在DNA聚合酶作用下进行反应，检测纳米孔中合成过程的A、T、C、G这四种荧光标记的脱氧核苷酸，即可实现核酸测序；第二，利用共聚焦显微镜实时、快速地对集成在SMRTcell上的无数的纳米孔同时进行记录。PacBio核酸测序平台，其平均读长可达10-20k，且测序不受AT和CG含量的影响，能够对高GC含量或低GC含量的区域进行测序，相比二代测序有较大优势。海洋动物与软体动物使用目前常规的PacBio基因组建库测序效果很差。海洋软体动物体内含有一些杂质(比如有的物种蛋白含量高、有的物种糖分含量高)影响了建库测序过程中酶的活性，从而造成PacBioSequel测序过程中聚合酶读长短和数据产出低的现象。现有技术中主要是在DNA提取时进行纯化去除杂质。纯化方法主要是磁珠纯化和试剂盒纯化，磁珠纯化方便快捷但无法完全去除海洋软体动物的杂质；目前市面上试剂盒大部分是针对二代小片段文库的，会影响DNA片段的完整性，因此，使用试剂盒纯化回收率低、效果也不佳。
技术实现思路
针对现有技术中存在的技术问题，本专利技术提出了一种适用于PacBio测序平台的海洋动物与软体动物的建库测序方法，该方法可有效去除海洋软体动物体内所含杂质，可以显著提高PacBio测序聚合酶读长和数据产量。为实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种适用于PacBio测序平台的海洋动物与软体动物的建库测序方法，包括如下步骤：1)对打断的DNA大片段进行切胶纯化；2)对纯化的DNA大片段进行核酸外切酶VII消化；3)对核酸外切酶VII消化产物进行第一次DNA损伤修复；4)对第一次DNA损伤修复的产物进行末端修复处理和加接头处理；5)对加接头的产物进行外切酶ExoIII和ExoVII双酶切处理；6)对外切酶ExoIII和ExoVII双酶切处理的产物进行二次筛选目的片段；7)对二次筛选产物进行第二次DNA损伤修复，即获得适用于Pacbio平台的DNA大片段文库；8)文库质检；9)上机测序。进一步地，所述切胶纯化的回收范围为5-50kb。进一步地，所述加接头处理中，接头序列如为SeqIDNo.1所示。本专利技术的第二个目的在于提出一种用于PacBio测序平台的海洋动物与软体动物文库构建试剂盒，包括：1)为ExoVII酶处理试剂，由ExoVII酶和ExoVII酶切反应缓冲液组成；2)DNA损伤修复试剂，包括DNA损伤修复酶及其反应缓冲液；3)末端修复处理试剂，包括DNA聚合酶及其反应缓冲液；4)加接头处理试剂，包括连接酶、接头核酸片段、连接酶反应缓冲液；5)双酶切处理试剂，由ExoIII酶和双酶切缓冲液组成；所述试剂盒还包括用于切胶纯化的核酸片段回收系统。进一步地，所述切胶纯化的回收范围为5-50kb。进一步地，所述试剂盒还包括磁珠纯化试剂，包括磁珠溶液、清洗溶液、洗脱液。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：本专利技术的方法针对因海洋软体动物含杂质量高而造成PacBioSequel测序过程中聚合酶读长短和数据产出低的问题，在建库过程中，在DNA打断与核酸外切酶VII消化之间增加一步BluePippin切胶纯化DNA，可以有效去除海洋软体动物所含的杂质，减少杂质对酶活性的干扰，显著提高PacBioSequel测序聚合酶读长和数据产量。附图说明图1为本专利技术的适用于PacBio测序平台的海洋动物与软体动物的建库测序流程图。图2为实施例1中海虾pacbio基因组20kb文库建库方法建库的文库检测结果示意图.图3为实施例1中海虾样品采用本专利技术的方法建库的文库检测结果示意图。图4为实施例2中螺样1pacbio基因组20kb文库建库方法建库的文库检测结果示意图.图5为实施例2中螺样1采用本专利技术的方法建库的文库检测结果示意图。图6为实施例2中螺样2pacbio基因组20kb文库建库方法建库的文库检测结果示意图。图7为实施例2中螺样2采用本专利技术的方法建库的文库检测结果示意图。具体实施方式展示一下实例来具体说明本专利技术的某些实施例，且不应解释为限制本专利技术的范围。对本专利技术公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本专利技术的的精神和范围之内。本专利技术针对因海洋软体动物含杂质量高而造成PacBioSequel测序过程中聚合酶读长短和数据产出低的问题，设计了一种适用于PacBio测序平台的海洋动物与软体动物的建库测序方法，在DNA打断与核酸外切酶VII消化之间增加一步BluePippin切胶纯化DNA，从而去除海洋软体动物所含的杂质，减少杂质对酶活性的干扰。具体地如图1所示，该方法是通过以下步骤实现的：1)对打断的DNA大片段进行切胶纯化；2)对纯化的DNA大片段进行核酸外切酶VII消化；3)对核酸外切酶VII消化产物进行第一次DNA损伤修复；4)对第一次DNA损伤修复的产物进行末端修复处理和加接头处理；5)对加接头的产物进行外切酶ExoIII和ExoVII双酶切处理；6)对外切酶ExoIII和ExoVII双酶切处理的产物进行二次筛选目的片段；7)对二次筛选产物进行第二次DNA损伤修复，即获得适用于Pacbio平台的DNA大片段文库；8)文库质检；9)上机测序。实施例1：本实施例以海洋虾样本为例，提供一种适用于PacBio测序平台的海洋动物与软体动物的建库方法(同时以海虾的pacbio基因组20kb文库建库方法作为对比实验)，具体实验过程如下：1.基因组DNA样本的打断基因组DNA的打断使用gTube进行，具体操作流程如下：1)取10μg的基因组DNA，使用无核酸酶水稀释至150μL，加入至gTube管中；2)放置于Eppendorf5424离心机上，使用3000rpm的速度，将基因组样本打断至20KB；3)使用0.45XAMPurePB磁珠进行纯化，最后使用30μL无核酸酶水洗脱。2.BluePippin切胶回收打断后的样本使用BluePippin进行切胶回收，具体操作流程如下：1)选择“0.75％，DFMarkerS1high-pass5-10kb”程序进行片段回收；2)回收范围设定为5-50kb；3)回收产物使用1XAMPurePB磁珠进行纯化，最后使用38μLElutionBuffer洗脱。3.核酸外切酶VII消化按表1所示配制反应体系，充分混匀，短暂离心后，放入Thermomixer中，37℃温浴15min后置于冰上，完成ExoVII酶处理。表1核酸外切酶VII消化反应体系4.DNA损伤修复按表2所示配制反应体系，充分混匀，瞬时离心，37℃孵育30min，置于冰上。表2DNA损伤修复反应体系5.末端修复1)按表3所示配制反应体系，充分混匀，瞬时离心，25℃孵育5min；表3末端修复反应体系2)使用0.45本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种适用于PacBio测序平台的海洋动物与软体动物的建库测序方法，其特征在于，包括如下步骤：1)对打断的DNA大片段进行切胶纯化；2)对纯化的DNA大片段进行核酸外切酶VII消化；3)对核酸外切酶VII消化产物进行第一次DNA损伤修复；4)对第一次DNA损伤修复的产物进行末端修复处理和加接头处理；5)对加接头的产物进行外切酶ExoIII和ExoVII双酶切处理；6)对外切酶ExoIII和ExoVII双酶切处理的产物进行二次筛选目的片段；7)对二次筛选产物进行第二次DNA损伤修复，即获得适用于Pacbio平台的DNA大片段文库；8)文库质检；9)上机测序。

【技术特征摘要】
1.一种适用于PacBio测序平台的海洋动物与软体动物的建库测序方法，其特征在于，包括如下步骤：1)对打断的DNA大片段进行切胶纯化；2)对纯化的DNA大片段进行核酸外切酶VII消化；3)对核酸外切酶VII消化产物进行第一次DNA损伤修复；4)对第一次DNA损伤修复的产物进行末端修复处理和加接头处理；5)对加接头的产物进行外切酶ExoIII和ExoVII双酶切处理；6)对外切酶ExoIII和ExoVII双酶切处理的产物进行二次筛选目的片段；7)对二次筛选产物进行第二次DNA损伤修复，即获得适用于Pacbio平台的DNA大片段文库；8)文库质检；9)上机测序。2.根据权利要求1所述的一种适用于PacBio测序平台的海洋动物与软体动物的建库测序方法，其特征在于，所述切胶纯化的回收范围为5-50kb。3.根据权利要求1所述的一种适用于PacBio测序平台的海洋动物与软体动物的建库测序方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈逢，
申请(专利权)人：嘉兴菲沙基因信息有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33