本发明专利技术公开了一种来源于嗜热毁丝霉菌(Myceliophthora thermophila)的多糖裂解单加氧酶基因及其酶的制备方法与应用，即利用基因工程的技术方法，将该多糖裂解单加氧酶的基因克隆到毕赤酵母表达载体上，获得可异源表达该酶的毕赤酵母重组菌株，该菌株异源表达制备的多糖裂解单加氧酶，能高效降解纤维素(氧化裂解β‑1,4‑糖苷键)。本发明专利技术提供的多糖裂解单加氧酶可广泛应用于能源、农业、食品、饲料添加剂、医药等领域。
A Polysaccharide Pyrolysis Monooxygenase Coding Gene and Its Enzyme Preparation and Application
【技术实现步骤摘要】
一种多糖裂解单加氧酶编码基因及酶和制备与应用
本专利技术涉及一种多糖裂解单加氧酶的基因序列及其酶的制备方法和应用。本专利技术提供了该多糖裂解单加氧酶的重组质粒和重组基因工程菌株及其在多糖降解方面的应用。本专利技术提供的多糖裂解单加氧酶可广泛应用于能源、农业、食品、饲料添加、医药等领域。
技术介绍
植物细胞壁主要由多糖和木质素组成。在植物细胞壁的干重组成中，纤维素，半纤维素和木质素分别占20-50％，15-35％，和10-30％。其中，纤维素是自然界分布最广泛，含量最多的生物质来源，对纤维素的有效利用，能为人类社会提供大量的化学品与能源品。纤维素利用有多种方法，其中生物法具有环境友好、条件温和等优势，但生物法利用纤维素的一个瓶颈问题是酶降解效率低、成本高。这是因为纤维素具有生物质抗降解屏障。传统的纤维素酶系均属于糖苷水解酶家族，主要包括内切β-1,4-葡聚糖酶，纤维二糖水解酶和β-1,4-葡萄糖苷酶。糖苷水解酶对纤维素的结晶区降解困难，只能在纤维素的非结晶区降解，使得其在工业应用中成本较高，不利于生物质的转化利用。2010年，研究人员发现了一类具有氧化活性的金属酶，可以通过氧化的方式裂解多糖中的糖苷键。这类多糖裂解单加氧酶(LPMO)是一类能够降解多糖的氧化酶，在电子供体和氧气存在的条件下，氧化裂解糖苷键，生成含氧化糖链末端的寡糖片段。LPMO能够和糖苷水解酶协同作用，提高难溶底物的降解效率。多糖裂解单加氧酶分为细菌和真菌两种来源，其中细菌来源的LPMO属于具有辅助活性的AA(AuxiliaryActivity)10家族，主要降解几丁质，少部分可以降解纤维素；真菌来源的LPMO分为AA9，AA11和AA13家族，主要降解底物分别为纤维素、淀粉和几丁质。其中，AA9家族的LPMO底物降解纤维素中的β-1,4糖苷键，也对其它含有β-1,4-D-葡萄糖苷键的底物有一定的降解作用。AA9家族的LPMO也曾被分类为糖苷水解酶GH(GlycosideHydrolase)61家族。AA9家族的LPMO按照氧化位点不同分为三类，PMO1s和PMO2s分别为C1位和C4位氧化，PMO3s为C1和C4同时氧化。AA9家族的LPMO具有高度的同源性，和相似的β三明治结构，其活性中心由二价铜离子和与之共轭的组氨酸环组成。嗜热毁丝霉(MyceliophthorathermophileATCC42464，后更名为Thermothelomycesthermophila)具有较强的纤维素降解能力，在纤维素利用过程中有潜在应用价值。国际酶制剂巨头诺维信将嗜热毁丝霉作为提升纤维素降解能力的重要资源之一，利用大麦秸秆木质纤维素所谓底物，该公司发现将嗜热毁丝霉粗酶与纤维素酶连用可大幅提高降解能力。2011年，嗜热毁丝霉基因组被测序，使得对嗜热毁丝霉中多糖裂解单加氧酶的研究成为可能。目前，仅有三篇关于嗜热毁丝霉菌来源的LPMO的报道。2015年，发现MtLPMO9A对纤维素和木聚糖具有氧化活力，以及对纤维素酶的协同增效作用，但尚无相关机制研究。2016年，研究了底物和还原剂对嗜热毁丝霉来源的LPMO降解过程的影响，研究了其底物降解模式，并预测其结构。2017年，以MtPMO3为例，对LPMO中铜离子活性中心的次级共轭结构进行了研究。目前嗜热毁丝霉菌来源的多糖裂解单加氧酶主要为机制研究，对于酶学性质、纤维素以外的底物特异性、协同效果等研究较少。本专利技术申报书中对多糖裂解单加氧酶MtLPMO9E进行了克隆表达及纯化，并对其酶学性质、底物特异性、酶活性、及其与糖苷水解酶协同能力进行了表征。多糖裂解单加氧酶MtLPMO9E具有广泛的pH适用范围，在酸性及碱性条件下，均能有效氧化裂解纤维素中β-1,4-糖苷键，说明该多糖裂解单加氧酶可以应用于多种具有不同预处理方式的纤维素底物。多糖裂解单加氧酶MtLPMO9E的Tm值为52℃，具有较高的耐热能力，能够满足生物法降解利用纤维素的温度条件。多糖裂解单加氧酶MtLPMO9E除能够降解纤维素中β-1,4-糖苷键，对其它同时含有葡萄糖及β-1,4-糖苷键的底物，如木葡聚糖，也有较强的氧化和结合的能力，预期在实际应用中对半纤维素也有一定的降解作用。多糖裂解单加氧酶MtLPMO9E能够氧化裂解纤维素中β-1,4-糖苷键，同时生成水解产物和氧化产物，并能够与纤维素水解酶混合酶Cellulast1.5L协同，有效提高降解效率。本专利所述基因和氨基酸序列未见文献或专利报道。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种新型的来源于嗜热毁丝霉菌(MyceliophthorathermophileATCC42464)的多糖裂解单加氧酶MtLPMO9E及其编码基因。本专利技术的第二个目的是提供一种制备新型多糖裂解单加氧酶MtLPMO9E的方法。本专利技术的第三个目的是提供含有所述的多糖裂解单加氧酶MtLPMO9E基因重组表达质粒和重组基因工程菌株。本专利技术的第四个目的是提供一种新型多糖裂解单加氧酶MtLPMO9E在β-1,4-糖苷键降解中的应用。本专利技术所提供的多糖裂解单加氧酶MtLPMO9E，来源于土壤中分离纯化的嗜热毁丝霉菌，从中扩增出的多糖裂解单加氧酶MtLPMO9E编码基因(命名为MtLPMO9E)，具有下述核苷酸序列特征中的一种或二种以上：1)序列表中SEQIDNO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；2)编码序列表中SEQIDNO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；3)与SEQIDNO.1限定的脱氧核糖核酸(DNA)序列的同源性达到80％及以上，且能编码降解β-1,4-葡聚糖的蛋白质的脱氧核糖核酸(DNA)序列；4)对序列表中SEQIDNO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或几个核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有多糖裂解单加氧酶活性的核苷酸序列。本专利技术还提供了多糖裂解单加氧酶MtLPMO9E的氨基酸序列，具有如下特征中的一种或二种以上：1)序列表中的SEQIDNO.2从氨基端开始的第1-229位氨基酸残基序列，其中1-229位为具有多糖裂解单加氧酶LPMO9E活性的氨基酸序列；2)将序列表中的SEQIDNO.2从氨基端开始的第1-229位氨基酸残基进行一个或两个以上氨基酸取代、缺失或添加而形成具有多糖裂解单加氧酶活性不变的氨基酸序列。制备重组酶MtLPMO9E的方法，是将多糖裂解单加氧酶基因克隆入重组表达载体，或按照多糖裂解单加氧酶氨基酸序列设计适合宿主细胞的基因序列克隆入表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的多糖裂解单加氧酶。上述多糖裂解单加氧酶基因，其核苷酸序列具有如下特征中的一种或二种以上：1)具有序列表中SEQIDNO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；2)编码SEQIDNO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；3)对序列表中SEQIDNO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或两个以上核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有多糖裂解单加氧酶活性的核苷酸序列；所述的重组表达多糖裂解单加氧酶MtLPMO9E的表达载体可以是大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体等。用于重组表达多糖裂解单加本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种多糖裂解单加氧酶基因，其核苷酸序列具有如下特征中的一种或二种以上：1)具有序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；2)编码SEQ ID NO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；3)对序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或两个以上核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有多糖裂解单加氧酶活性的核苷酸序列；4)与SEQ ID NO.1限定的脱氧核糖核酸(DNA)序列的同源性达到80％及以上，且能编码降解纤维素的蛋白质的脱氧核糖核酸(DNA)序列。
【技术特征摘要】
1.一种多糖裂解单加氧酶基因，其核苷酸序列具有如下特征中的一种或二种以上：1)具有序列表中SEQIDNO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；2)编码SEQIDNO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；3)对序列表中SEQIDNO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或两个以上核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有多糖裂解单加氧酶活性的核苷酸序列；4)与SEQIDNO.1限定的脱氧核糖核酸(DNA)序列的同源性达到80％及以上，且能编码降解纤维素的蛋白质的脱氧核糖核酸(DNA)序列。2.一种权利要求1所述的多糖裂解单加氧酶基因编码的多糖裂解单加氧酶，其特征在于：其氨基酸序列具有如下特征中的一种或二种：1)序列表中SEQIDNO.2从氨基端开始的第1-631位氨基酸残基序列；2)对序列表中SEQIDNO.2所示的氨基酸序列进行一个或两个以上氨基酸取代、缺失或添加而形成的具有多糖裂解单加氧酶活性的氨基酸序列。3.一种权利要求2所述的多糖裂解单加氧酶的制备方法，其特征在于：将多糖裂解单加氧酶基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的多糖裂解单加氧酶；上述多糖裂解单加氧酶基因，其核苷酸序列具有如下特征中的一种或二种以上：1)具有序列表中SEQIDNO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；2)编码SEQIDNO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；3)对序列表中SEQIDNO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或两个以上核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有多糖裂解单加氧酶活性的核苷酸序列；4)与SEQIDNO.1限定的脱氧核糖核酸(DNA)序列的同源性达到80％及以上，且能编码降解纤维素的蛋白质的脱氧核糖核酸(DNA)序列。4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的重组表达多糖裂解单加氧酶的表达载体，是指大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体中的一种或二种以上。...
【专利技术属性】
技术研发人员：尹恒，于作琛，周海川，鞠酒，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21
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