一种双功能溶瘤病毒及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种双功能溶瘤病毒，在溶瘤病毒的分子结构中插入表达免疫检查点阻断剂的功能片段。本发明专利技术提供的基因改造的柯萨奇溶瘤病毒，改变了实体瘤的肿瘤微环境，病毒直接溶瘤的同时增强了机体自身的免疫抗肿瘤能力，整体抗肿瘤效果得到增强，且安全性良好。

A Bifunctional Oncolytic Virus and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种双功能溶瘤病毒及其应用
本专利技术涉及病毒生物学、肿瘤生物学领域，具体涉及一种双功能溶瘤病毒及其抗肿瘤应用。
技术介绍
病毒具有侵染细胞的能力，进入细胞的病毒会复制病毒基因组，表达病毒蛋白并包装形成新的病毒颗粒，通常这个过程会导致宿主细胞裂解死亡。在此思路上，对病毒进行一定程度的修改，保持对肿瘤细胞的裂解能力的同时，降低对机体的毒性，由此便形成溶瘤病毒。另外，溶瘤病毒可以通过损伤相关的分子模式(damageassociatedmolecularpatterns，DAMPs)等，激活免疫系统，将“冷肿瘤”变成“热肿瘤”；裂解产生的肿瘤抗原，激活特异性免疫，形成原位肿瘤疫苗。溶瘤病毒大多来源于人体非致病性病毒或致病性轻微的病毒，在保证施用安全的前提下，溶瘤效果仍有待提高。已有报道证实，溶瘤病毒与其它抗肿瘤药物联用，可以取得更好的抗肿瘤效果。肿瘤细胞与正常细胞相比具有许多遗传性以及表观遗传性改变，理论上可以提供足够数量的抗原被免疫系统识别区分，进而引发抗肿瘤免疫反应。但是肿瘤相关的免疫抑制使得肿瘤抗原难以引发有效的抗肿瘤免疫。在有效的抗肿瘤免疫过程中，T细胞作为核心的执行者，首先被T细胞受体介导的抗原识别信号激活，同时众多的共刺激信号和共抑制信号精细调节T细胞反应的强度和质量，这些抑制信号即为免疫检查点。肿瘤细胞发展出多种途径抑制体内免疫细胞的杀伤。其中一种方式是通过识别免疫细胞的免疫检查点，躲避免疫细胞的识别和攻击。免疫检查点阻断剂阻断了肿瘤细胞对免疫细胞的伪装，免疫细胞从而能够正确识别肿瘤细胞并进行特异性杀伤。并在此理论指导下，研发出一系列单克隆抗体药物，例如CTLA-4抗体药物Ipilimumab；PD-1抗体药物Pembrolizumab和Nivolumab；PD-L1抗体药物Atezolizumab和Durvalumab。免疫检查点阻断剂并非对所有患者有效，如PD-1抑制剂治疗实体瘤有效率只有20％，肿瘤局部复杂的肿瘤微环境仍是阻碍其成功应用于乳腺癌、肺癌、结肠癌、肝癌和胰腺癌等肿瘤的主要障碍。打破肿瘤微环境，重新激发机体对肿瘤细胞的免疫杀伤，是目前实现高效低毒抗肿瘤目标的重要实现途径。
技术实现思路
本专利技术提供了柯萨奇B3病毒通过载体功能表达抗肿瘤免疫调节蛋白技术方案与成果。将现有的免疫检查点单抗与溶瘤病毒有机结合，有可能实现溶瘤病毒递送表达抗肿瘤蛋白的作用。因此，本专利技术提供了一种能够表达免疫检查点阻断剂的柯萨奇溶瘤病毒，在实现病毒裂解肿瘤细胞功能的同时，实现体内表达免疫检查点阻断剂抗肿瘤的功能。本专利技术具体技术方案如下一种双功能溶瘤病毒，其特征在于所述双功能溶瘤病毒在病毒的基本分子结构中插入有一种或几种表达免疫检查点阻断剂的功能片段，所述溶瘤病毒为小RNA病毒，所述小RNA病毒包括肠病毒属、鼻病毒属、肝病毒属、副肠孤病毒属、嵴病毒属，所述肠病毒属包括脊髓灰质炎病毒、肠病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒等。本专利技术所述的双功能溶瘤病毒能够保持原有裂解肿瘤细胞的功能，且能够表达一种或几种免疫检查点阻断剂。本专利技术的一个优选方案，选用柯萨奇病毒作为溶瘤病毒，包括柯萨奇A组病毒和柯萨奇B组病毒。优选的柯萨奇B组病毒包括柯萨奇B1-B6，6个亚型。进一步优选柯萨奇B3病毒。柯萨奇B3病毒包括常见的Nancy株、Woodruff株、H3株、H21/0株、CV-B3/20株、CV-B3/28株、CV-B3/0株、CV-B3/GA株、CV-B3/CO株及其变种，以及临床分离株。本专利技术所述的双功能溶瘤病毒，所述免疫检查点阻断剂为抑制性免疫共刺激分子的受体PD-1、KIR、LAG3、TIM3、A2aR、CTLA-4、BTLA或配体PD-L1、PD-L2、CD80、CD86、CD155、B7-H3、B7-H4、B7-H5、HVEM、GAL9、MHCclassIorII的抗体或具有抗原结合部位的片段或其组合，所述具有抗原结合部位的片段为Fab或scFv。本专利技术的一个优选方案以PD-1分子位点作为免疫检查点，免疫检查点阻断剂为PD-1抑制剂，优选为抗-PD-1的抗体或抗体样分子，或具有PD-1抗原结合部位的片段。优选的scFv，是通过柔性链接连接的VH和VL，例如常用(Gly4Ser)3连接VH和VL成为连续的单链蛋白。本专利技术所述的双功能溶瘤病毒，保持了小RNA病毒的基本分子结构，在病毒元件之间插入表达免疫检查点阻断剂的基因，且通过分子生物学和病毒学原理进行设计，形成插入蛋白的游离表达。本专利技术一个优选的方案，在柯萨奇B3病毒H3株(GenBankAccession：U57056)基因组序列的5'非翻译区和蛋白P1区之间插入抗人PD-1单克隆抗体scFv序列。上述抗人PD-1单克隆抗体scFv序列核苷酸序列如SEQIDNo：5所示。本专利技术具体的一种双功能溶瘤病毒，其感染性克隆的核苷酸序列如SEQIDNo：11所示。本专利技术的另一目的在于提供所述双功能溶瘤病毒在制备抗肿瘤药物中的应用。所述肿瘤选自骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、阴户癌、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统的癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统的赘生物、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的其它癌症和上述各种癌症的组合类型。本专利技术的另一目的在于提供一种抗肿瘤药物，含有本专利技术所述的双功能溶瘤病毒。本专利技术所述的双功能溶瘤病毒既可以用作单一药剂进行抗肿瘤治疗，也可以与手术切除、放疗、化疗、靶向药物治疗和其它免疫治疗联合使用进行抗肿瘤治疗。并且通过优选的联合实施方案，改善抗肿瘤效果。本专利技术所述的双功能溶瘤病毒及其联合治疗药物可以使用各种已知的途径给予人体或动物受试者。例如，可以通过常规针头或影像辅助的体内定点给药方式，通过肿瘤内、肠胃内外、皮下、口腔、表皮、皮内、肌肉内、腹膜内和血管内。亦可通过喷雾、液体制剂、膏剂、片剂等已知剂型等给予鼻腔、眼内、气管内、肠内、耳内等。本专利技术优点：本专利技术所述的溶瘤病毒在肿瘤细胞内完成病毒生活周期“复制-包装-释放”，导致肿瘤细胞裂解和肿瘤抗原释放，病毒感染肿瘤细胞引起局部炎症并激活先天免疫反应。利用溶瘤病毒的载体功能，在肿瘤内原位表达表达免疫检查点阻断剂，进一步增强了T细胞的肿瘤免疫反应和抑制肿瘤细胞的活性。附图说明图1为本专利技术提供的表达外源抗肿瘤蛋白基因改造的溶瘤柯萨奇病毒的基因结构示意图。图2为本专利技术表达外源抗肿瘤蛋白基因改造的溶瘤柯萨奇病毒拯救盲传镜检结果。图3为利用qPCR检验本专利技术插入溶瘤柯萨奇病毒的外源基因的稳定性结果。图4为插入Ono外源基因的溶瘤柯萨奇病毒杀伤A549肺癌细胞的镜检结果。图5为本专利技术提供的溶瘤柯萨奇病毒杀伤小鼠肿瘤模型的终点记录。具体实施方式实施例1带有抗人PD-1单克隆抗体的柯萨奇B3病毒的制备以柯萨奇B3病毒H3株(GenBankAccession：U57056)序列为基础，在H3基因组序列的5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种双功能溶瘤病毒，其特征在于所述双功能溶瘤病毒在溶瘤病毒的分子结构中插入一种或几种表达免疫检查点阻断剂的功能片段，所述溶瘤病毒为小RNA病毒。

【技术特征摘要】
1.一种双功能溶瘤病毒，其特征在于所述双功能溶瘤病毒在溶瘤病毒的分子结构中插入一种或几种表达免疫检查点阻断剂的功能片段，所述溶瘤病毒为小RNA病毒。2.如权利要求1所述的双功能溶瘤病毒,其特征在于所述小RNA病毒包含肠病毒属、鼻病毒属、肝病毒属、副肠孤病毒属、嵴病毒属。3.如权利要求2所述的双功能溶瘤病毒,其特征在于所述肠病毒属包括脊髓灰质炎病毒、肠病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒。4.如权利要求3所述的双功能溶瘤病毒,其特征在于所述柯萨奇病毒包括柯萨奇A组病毒和柯萨奇B组病毒。5.如权利要求4所述的双功能溶瘤病毒,其特征在于所述柯萨奇病毒为柯萨奇B3病毒。6.如权利要求1所述的双功能溶瘤病毒,其特征在于所述免疫检查点阻断剂为抑制性免疫共刺激分子的受体PD-1、KIR、LAG3、TIM3、A2aR、CTLA-4、BTLA或配体PD-L1、PD-L2、CD80、CD86、CD155、B7-H3、B7-H4、B7-H5、HVEM、GAL9、MHCclassIorII的抗体或具有抗原结合部位的片段或其组合。7.如权利要求6所述的双功能溶瘤病毒，其特征在于所述具有抗原结合部位的片段为Fab或scFv。8.如权利要求1-7任一项所述的双功能溶瘤病毒，其特征在于保持小RNA病毒分子基本结构，在病毒元件之间插入表达免疫检查点阻断剂的基因。9.如权利要求1所述的双功能溶瘤病毒,其特征在于所述溶瘤病毒为柯萨奇B3病毒，所述表达免疫检查点阻断剂为PD-1的抗体或具有PD-1抗原结合部位的片段或其组合。10....

【专利技术属性】
技术研发人员：高鹏，应述欢，李玉霞，谢国明，
申请(专利权)人：胜武北京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11