提高分泌型蛋白的成熟肽产生的方法技术

本申请提供了用于表达成熟肽的融合蛋白以及编码所述融合蛋白的核酸分子、产生所述融合蛋白或成熟肽的方法。

Methods for Increasing the Production of Mature Peptides of Secretory Proteins

【技术实现步骤摘要】
提高分泌型蛋白的成熟肽产生的方法
本申请大体上涉及生物工程领域。具体而言，本申请提供了提高分泌型蛋白的成熟肽产生的方法，其中通过改造包含前导肽和成熟肽的前体蛋白的结构来提高成熟肽的产生。
技术介绍
在生物学领域中，一些分泌型蛋白在细胞内最初表达时为包含前导肽和成熟肽的前体蛋白，随后在胞外分泌的过程中，前导肽被切除，成熟肽被分泌至胞外并发挥生物学作用。例如，米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucormieheilipase,RML)是分泌型蛋白中的一种，其具有较强sn-1,3选择性以及高活力的特性，已被广泛用于结构脂质的酶法合成，如SOS、OPO、DAG的合成，处理鱼油富集DHA等多不饱和脂肪酸以及手性医药中间体及某些生物材料的制备。天然的米黑根毛霉脂肪酶产量低、成分不稳定，提取困难，使得其无法工业化生产。因此，针对米黑根毛霉脂肪酶的研究主要集中在其酶学性质、应用范围以及在基因工程菌中的高效表达。1988年，诺维信公司的Boel和Huge-jensen确定了编码米黑根毛霉脂肪酶的cDNA序列，并确定米黑根毛霉脂肪酶前体蛋白是由米黑根毛霉脂肪酶成熟肽、70个氨基酸残基的前体肽及24个氨基酸残基的信号肽构成，通过酶切割前体蛋白的MET-SER之间的肽键而得到269个氨基酸残基的米黑根毛霉脂肪酶成熟肽。1989，Huge-jensen将米黑根毛霉脂肪酶的前体蛋白基因插入米曲霉的载体中，利用α-淀粉酶基因的启动子和糖化酶的终止子进行表达得到胞外分泌的rRML。利用该表达载体得到的rRML中有70％的N-端氨基酸序列与天然酶一致，而另外的30％的重组酶比天然酶少一个丝苏氨酸残基。此外，重组酶的等电点为4.3，其与米黑根毛霉脂肪酶一致，含糖量为1.2％，免疫性质也与天然酶高度相似。目前诺维信公司市场上销售的米黑根毛霉脂肪酶也是利用基因工程技术以米曲霉为载体表达的基因改性脂肪酶，液体酶商品名为20000L，固定化酶商品名为LipozymeRMIM。然而，尽管真菌米曲霉是一种优良的表达载体，但其自身会分泌各种非目标蛋白，例如：在诺维信的LipozymeRM的酶液中，非目的蛋白淀粉酶的含量远高于目的蛋白RML，此外，还有很多其他杂蛋白如蛋白酶等，这导致其应用受到很大限制。目前，尽管诺维信将RML液体经过再次提纯，获得商品名为388的RML，但因其价格昂贵，进一步限制了其在工业中的应用。因此，对于分泌型蛋白(例如米黑根毛霉脂肪酶)的基因工程制备方法的改进是本领域迫切需要的。专利技术概述第一方面，本申请提供了融合蛋白，其包含第一前导肽部分、柔性肽接头和成熟肽部分。在一些实施方案中，第一前导肽部分、柔性肽接头和成熟肽部分沿融合蛋白的N端至C端的方向存在于融合蛋白。在一些实施方案中，所述融合蛋白还包含位于第一前导肽部分的N端侧的信号肽。在一些实施方案中，柔性肽接头和成熟肽之间包括第一酶切位点。在一些实施方案中，融合蛋白进一步包含第二前导肽部分，第二前导肽部分位于第一前导肽部分和成熟肽部分之间。第一前导肽部分和第二前导肽部分可以相同或不同，优选相同。在一些实施方案中，第二前导肽部分位于第一前导肽部分和柔性肽接头之间。在一些实施方案中，第一前导肽部分和第二前导肽部分之间包括第二酶切位点。在一些实施方案中，柔性肽接头包含氨基酸序列(GS)a(GGS)b(GGGS)c(GGGGS)d，其中a、b、c和d是大于或等于0的整数，且a+b+c+d≥1。在一些实施方案中，柔性肽接头包含氨基酸序列GGGSGGGS、GGGSGGGS、GGSGGSGGS、GSGSGSGSGS、GSGGSGS、GGSGGGS、GGGSGGGGS、GSGGSGGGS、GGGGSGGS、GSGGGSGGGGSGGGGS、GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS、GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS、GSGGGGSGGGGSGGGGS、GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS、GGSGGSGGSGGS或GGGGSGGGSGS。在一些实施方案中，柔性肽接头包含氨基酸序列(GGGGS)2。在一些实施方案中，信号肽部分、第一前导肽部分、第二前导肽部分、成熟肽部分独立地来自微生物来源脂肪酶。在一些实施方案中，微生物为细菌、真菌或酵母。在一些实施方案中，微生物为真菌。在一些实施方案中，微生物为霉菌。在一些实施方案中，微生物为米黑根毛霉菌、米根霉菌或华根霉菌。在一些实施方案中，第一前导肽部分、第二前导肽部分、成熟肽部分来自同一微生物物种来源的脂肪酶。在一些实施方案中，第一和/或第二酶切位点独立地或共同地为kex2/ste13酶切位点。在一些实施方案中，信号肽和/或第一前导肽部分和/或第二前导肽部分以及成熟肽部分来自米黑根毛霉脂肪酶，第一和第二酶切位点均为kex2/ste13酶切位点，柔性肽接头为GGGGSGGGGS。在一些实施方案中，信号肽部分选自黑根毛霉脂肪酶的信号肽、华根霉脂肪酶的信号肽、米根霉脂肪酶的信号肽、a-因子信号肽、α-淀粉酶信号序列、葡糖淀粉酶信号序列、血清白蛋白信号序列、菊粉酶导肽、转化酶信号序列、杀手蛋白质信号序列或溶菌酶信号序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含SEQIDNo：5或SEQIDNo：7所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含SEQIDNo：5或SEQIDNo：7所示的氨基酸序列经取代、替换和/或增加1个或2个或3个氨基酸的活性变体。第二方面，本申请提供了编码第一方面所述的融合蛋白的核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子包含SEQIDNo：6或SEQIDNo：8所示的序列。第三方面，本申请提供了含有第二方面所述的核酸分子的载体。第四方面，本申请提供了含有第二方面所述的核酸分子或第三方面所述的载体的宿主细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞选自细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞和植物细胞。在一些实施方案中，宿主细胞为毕赤酵母(pichiapastoris)。在一些具体实施方案中，第一前导肽部分和/或第二前导肽部分和/或信号肽以及成熟肽部分的编码序列根据毕赤酵母的偏好密码子进行优化。第五方面，产生成熟肽的方法，其包括在允许融合蛋白表达的情况下，培养第四方面所述的宿主细胞，以及允许对所述融合蛋白进行切割，从而产生所述成熟肽。附图说明图1示出了融合蛋白pro/RML、2pro/RML、RMLprolinker和RML2prolinker的示意图。图2示出了pNP标准曲线。图3示出了pro/RML、2pro/RML、RMLprolinker和RML2prolinker各自的发酵酶活的比较。图4示出了pro/RML、2pro/RML、RMLprolinker和RML2prolinker的SDS-PAGE电泳图，从左至右依次为：Marker、RMLprolinker、pro/RML、RML2prolinker、2pro/RML。序列说明SEQIDNo：1为pro/RML的氨基酸序列。SEQIDNo：2为SEQIDNo：1的编码序列。SEQIDNo：3为2pro/RML的氨基酸序列。SEQIDNo：4为SEQIDNo：3的编码序列。SEQIDNo：5为RMLprolinker的氨基酸序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.融合蛋白，其包含第一前导肽部分、柔性肽接头和成熟肽部分，任选地，所述融合蛋白还包含位于第一前导肽部分的N端侧的信号肽部分。

【技术特征摘要】
1.融合蛋白，其包含第一前导肽部分、柔性肽接头和成熟肽部分，任选地，所述融合蛋白还包含位于第一前导肽部分的N端侧的信号肽部分。2.如权利要求1所述的融合蛋白，其中柔性肽接头和成熟肽部分之间包括第一酶切位点；和/或，其中所述融合蛋白进一步包含第二前导肽部分，所述第二前导肽部分位于所述第一前导肽部分和所述成熟肽部分之间，所述第二前导肽部分优选位于所述第一前导肽部分和所述柔性肽接头之间，第一前导肽部分和第二前导肽部分之间优选包括第二酶切位点，其中所述第一前导肽部分和第二前导肽部分可以相同或不同；和/或，所述柔性肽接头包含氨基酸序列(GS)a(GGS)b(GGGS)c(GGGGS)d，其中a、b、c和d是大于或等于0的整数，且a+b+c+d≥1；例如，柔性肽接头包含氨基酸序列GGGSGGGS、GGGSGGGS、GGSGGSGGS、GSGSGSGSGS、GSGGSGS、GGSGGGS、GGGSGGGGS、GSGGSGGGS、GGGGSGGS、GSGGGSGGGGSGGGGS、GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS、GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS、GSGGGGSGGGGSGGGGS、GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS、GGSGGSGGSGGS或GGGGSGGGSGS；优选地，柔性肽接头包含氨基酸序列(GGGGS)2。3.如前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中信号肽部分、第一前导肽部分、第二前导肽部分、成熟肽部分独立地来自微生物来源脂肪酶，所述微生物例如为细菌、真菌或酵母，优选为真菌，更优选为霉菌，最优选为米黑根毛霉菌、米根霉菌或华根霉菌；优选的，所述第一前导肽部分、第二前导肽部分、成熟肽部...

【专利技术属性】
技术研发人员：宣姚吉，徐正军，牛其文，
申请(专利权)人：丰益上海生物技术研发中心有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31