共价多特异性抗体制造技术

本发明专利技术涉及具有较高的稳定性的新型共价多特异性抗体及其治疗用途，例如，在免疫疗法中的应用。

Covalent multispecific antibodies

【技术实现步骤摘要】
共价多特异性抗体
本专利技术涉及具有较高的稳定性的新型共价多特异性抗体及其治疗用途，例如，用于免疫疗法。
技术介绍
单克隆抗体(mAb)在针对癌症和其他疾病的临床实际应用方面具有广泛的诊断和治疗潜力。无论是以裸抗体的形式还是以与细胞毒性剂(例如，放射性同位素，药物，毒素或前药转化酶)结合的偶联物的形式，单克隆抗体均在癌症免疫疗法中发挥重要作用。这些方法均处于疗效评估过程中，具有不同程度的发展并获得不同程度的临床成功。裸mAb可通过在与癌细胞上过表达的细胞表面蛋白结合之后诱导细胞毒性作用而实现临床反应。已有研究表明，通过经由程序性细胞死亡(凋亡)来控制肿瘤生长或通过诱导抗肿瘤免疫反应来实现这些治疗作用。由于抗体的特异性靶向并介导效应子功能这一独特性质，自1975年CesarMilstein和GeorgesJ.F.Kohler的单克隆抗体技术的专利技术以来，已研发出用作针对疾病的靶向免疫疗法的药物的抗体。目前已有超过60个被批准的基于抗体的生物药物，其全球年销售额超过50亿美元。当代抗体药物的成功应用已形成了药物产业并使得公共健康得到了很大改善。除了针对新型靶点的抗体药物的研发之外，最优的联合疗法和创新性的双特异性抗体的研发也有着广阔的前景。治疗性抗体已在临床应用超过20年。目前，临床使用的抗肿瘤抗体药物包括：美罗华(Rituxan(1997))，赫赛汀(Herceptin(1998))，Mylotarg(2000)，Campath(2001)，Zevalin(2002)，Bexxer(2003)，阿瓦斯汀(Avastin(2004))，爱必妥(Erbitux(2004))，Vectibix(2006)；Arzerra(2009)；Benlysta(2011)；Yervoy(2011)；Adcetris(2011)；Perjeta(2012)；Kadcyla(2013)，Opdivo(2014)，Keytruda(2014)，Tecentriq(2016)。这些抗体主要靶向EGFR，Her2，CD20或VEGF，以及最近发现的PD1或PD-L1。多功能抗体是基于传统抗体通过复杂的设计和分子工程而构建的，其具有多抗原结合能力。从实际应用方面来说，单个多功能抗体分子所产生的治疗效果与若干个传统抗体的组合所产生的治疗效果相同。然而，多功能抗体的优势远超过了若干个传统抗体的简单叠加。通过新的且独一无二的机理，所选择的多个靶点的同时接合可产生优于传统抗体的有益作用。例如，靶向CD3和CD19的博纳吐单抗(Blinatumomab，CD3xCD19，Amgen)在杀伤表达CD19的肿瘤细胞方面可通过其CD3-识别Fv而有效接合T细胞，其在ALL(急性淋巴性白血病)等适应症上展现出了超越传统抗体的显著疗效。博纳吐单抗已于2014年被美国FDA批准上市用于治疗ALL。已开发了多种双特异性抗体技术平台，包括：BITE(BispecificT-cellengaging，Micromet公司研发，2012年micromet公司被Amgen整体收购)、CrossMab(Roche)、DVD-Ig(Abbvie)、TandAb(Affimed)、DART(DualAntigenRe-Targeting，Macrogenics)、DuoBody(Genmab)等平台。这些平台所采用的构建方法各不相同，也各有其优缺点：BITE平台尽管具有很高的活性但是稳定性较差，易于聚集；CrossMab平台采用复杂的方法进行抗体构建并且需要根据不同母抗体的特性进行突变调整；DVD-Ig抗体的近端Fv无法进行膜蛋白结合，只能进行可溶性抗原结合；TandAb平台产生两条链仅通过VH-VL相互作用(通过在界面处形成疏水核)连接的抗体，虽然抗体在体外具有非常高的活性，但是，它们一旦进入体内由于双链的解离而迅速失活，半衰期短。此外，较高比例的错配也是一些双特异性抗体平台的普遍问题。因此无法采用传统的经典抗体纯化流程，这给抗体的下游工艺开发带来了诸多困难。而且，在大多数情况下，双特异性抗体的构建损害了抗体对单一抗原的二价结合能力，因此在不同程度上降低了抗体对抗原的选择性和亲和力。双特异性抗体通过化学交联、杂交-杂交瘤或转染瘤，或在两个不同的Fab’的铰链处进行二硫化物的交换而产生。第一种方法生成异源性且难以界定的产品。第二种方法需要对由多种杂交抗体副产物得到的双特异性抗体进行大量纯化，该纯化步骤可能会影响细胞交联活性。二硫化物交换方法实质上仅仅应用于F(ab’)2并且因此受到单克隆抗体易受到酶消化裂解的影响的限制。而且，因为Fab’彼此几乎没有亲和性，所以，形成Fab’间二硫键需要非常高的蛋白质浓度。二硫化物交换方法已通过使用Ellman试剂进行了改良，以在氧化前采用Fab’中的一个修饰另一个，这样，降低了同源二聚化的发生。然而，即便进行了这样的改良，在高于50％的产率中，异二聚F(ab’)2也鲜有产生。然而，不利的安全问题，低反应速度和有限的有效性是目前抗体药物的现状。这些不利因素可能来自于由于抗体的表位来自自身抗原而产生的对正常组织/细胞的非靶效应，免疫效应子细胞的抑制性微环境，未预料到的Fc介导的效应子功能，等等。因此，本领域仍然亟需有效生成高纯度的双特异性抗体的改进方法。
技术实现思路
一方面，本专利技术提供工程化抗体，其包含：(i)第一多肽，其包含与第一靶点结合的第一轻链可变结构域(VL1)和与第二靶点结合的第二重链可变结构域(VH2)，其中，VL1与VH2共价连接，以及(ii)第二多肽，其包含与所述第二靶点结合的第二轻链可变结构域(VL2)和与所述第一靶点结合的第一重链可变结构域(VH1)，其中，VL2和VH1共价连接，并且，其中，VL2和VH2共价连接，并且，其中，VL2和VH2均包含引入带电荷的氨基酸的一个或多个取代，所述带电荷的氨基酸对于同源二聚体的形成是静电学上不利的。在一些实施方式中，VL1的C端与VH2的N端共价连接，并且，VL2的C端和VH1的N端共价连接。在一些实施方式中，VL1的N端和VH2的C端共价连接，VL2的N端和VH1的C端共价连接。在一些实施方式中，VL1通过第一肽连接体与VH2连接，并且，其中，VL2通过第二肽连接体与VH1连接。在一些实施方式中，所述第一肽连接体和所述第二肽连接体分别独立地包含5至9个氨基酸。在一些实施方式中，VL2和VH2通过二硫键共价连接。在一些实施方式中，VL2的FR和VH2的FR通过二硫键共价连接。在一些实施方式中，VL2的FR的残基中的至少一个，优选仅仅一个，被带负电荷的氨基酸取代，并且VH2的FR的残基中的至少一个，优选仅仅一个，被带正电荷的氨基酸取代。在一些实施方式中，VL2的FR的残基中的至少一个，优选仅仅一个，被带正电荷的氨基酸取代，并且VH2的FR的残基中的至少一个，优选仅仅一个，被带负电荷的氨基酸取代。在一些实施方式中，带负电荷的氨基酸是天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)，并且，带正电荷的氨基酸是赖氨酸(K)或精氨酸(R)。在一些实施方式中，所述第一多肽和所述第二多肽分别独立地在其C端连接至IgG1，IgG2，IgG3或IgG4的铰链区。另一方面，本专利技术提供工程化抗体，其包含本文提供的抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种工程化抗体，其包括：(i)第一多肽，其包含结合第一靶点的第一轻链可变结构域(VL1)和结合第二靶点的第二重链可变结构域(VH2)，其中，所述VL1与所述VH2共价连接；以及(ii)第二多肽，其包含结合所述第二靶点的第二轻链可变结构域(VL2)和结合所述第一靶点的第一重链可变结构域(VH1)，其中，所述VL2与所述VH1共价连接；并且其中，所述VL2和所述VH2共价连接，并且其中，VL2和VH2分别包含引入带电荷的氨基酸的一个或多个取代，所述带电荷的氨基酸对于同源二聚体的形成是静电学上不利的。

【技术特征摘要】
1.一种工程化抗体，其包括：(i)第一多肽，其包含结合第一靶点的第一轻链可变结构域(VL1)和结合第二靶点的第二重链可变结构域(VH2)，其中，所述VL1与所述VH2共价连接；以及(ii)第二多肽，其包含结合所述第二靶点的第二轻链可变结构域(VL2)和结合所述第一靶点的第一重链可变结构域(VH1)，其中，所述VL2与所述VH1共价连接；并且其中，所述VL2和所述VH2共价连接，并且其中，VL2和VH2分别包含引入带电荷的氨基酸的一个或多个取代，所述带电荷的氨基酸对于同源二聚体的形成是静电学上不利的。2.如权利要求1所述的抗体，其中，所述VL1的C端和所述VH2的N端共价连接，所述VL2的C端和所述VH1的N端共价连接。3.如权利要求1所述的抗体，其中，所述VL1的N端和所述VH2的C端共价连接，所述VL2的N端和所述VH1的C端共价连接。4.如权利要求1至3中任一项所述的抗体，其中，所述VL1和所述VH2通过第一肽链连接体连接，并且，其中，所述VL2和所述VH1通过第二肽链连接体连接。5.如权利要求4所述的抗体，其中，所述第一肽链连接体和所述第二肽链连接体分别独立地包含5至9个氨基酸。6.如权利要求1所述的抗体，其中，所述VL2和所述VH2通过二硫键共价连接。7.如权利要求6所述的抗体，其中，所述VL2的FR和所述VH2的FR通过所述二硫键共价连接。8.如权利要求1所述的抗体，其中，所述VL2的FR被带负电荷的氨基酸取代，所述VH2的FR被带正电荷的氨基酸取代。9.如权利要求1所述的抗体，其中，所述VL2的FR被带正电荷的氨基酸取代，所述VH2的FR被带负电荷的氨基酸取代。10.如权利要求8或9所述的抗体，其中，所述带负电荷的氨基酸是天门冬氨酸(D)或谷氨酸(E)，所述带正电荷的氨基酸是赖氨酸(K)或精氨酸(R)。11.如权利要求1至10中任一项所述的抗体，其中，所述第一多肽和所述第二多肽分别独立地在其C端连接至IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4的铰链区。12.一种工程化抗体，其包含权利要求11所述的抗体的二聚体，其中，所述二聚体的每个单元通过铰链区连接。13.如权利要求1至12中任一项所述的抗体，其中，所述第一多肽和所述第二多肽分别独立地在其C端连接至Fc区域。14.如权利要求1至13中任一项所述的抗体，其中，所述第一多肽和所述第二多肽分别独立地在其C端连接至白蛋白或PEG。15.一种工程化抗体，其包含：(i)第一多肽，其包含结合第二靶点的第二轻链可变结构域(VL2)和结合第一靶点的第一重链可变结构域(VH1)，其中，所述VL2与所述VH1共价连接；(ii)第二多肽，其包含结合所述第一靶点的第一轻链可变结构域(VL1)，结合所述第二靶点的第二重链可变结构域(VH2)以及IgG的CH2-CH3结构域，其中，所述VL1与所述VH2共价连接；(iii)第三多肽，其包含结合第三靶点的第三重链可变结...

【专利技术属性】
技术研发人员：周桢昊，张洁，
申请(专利权)人：成都恩沐生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51