一种磺胺嘧啶半抗原改造及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种磺胺嘧啶半抗原改造及其应用，本发明专利技术提供了一种磺胺嘧啶改造方法，收率可达88.75％；最大限度保留了磺胺嘧啶的化学结构，提高了半抗原的特异性，为抗原制备加入连接点。经过柱净化浓缩以该半抗原为基础，可与载体蛋白偶联，用于免疫小鼠制备抗体，并以抗原抗体为基础开发胶体金试纸条检测产品。本发明专利技术的试纸条由微孔试剂和试纸条两部分构成，所述试纸条由PVC板、吸水垫、反应膜、吸收垫、保护膜五部分构成。所述吸收垫，反应膜，吸水垫和保护膜按顺序粘贴在PVC板上，反应膜上固定检测区(T)和质控区(C)。检测区包被有磺胺嘧啶半抗原‑牛血清白蛋白偶联物，质控区包被有羊抗鼠IgG。

Modification of a Sulfadiazine hapten and its application

【技术实现步骤摘要】
一种磺胺嘧啶半抗原改造及其应用
本专利技术涉及一种半抗原及其制备方法和应用，具体涉及磺胺嘧啶药物半抗原及其制备方法和应用。
技术介绍
磺胺嘧啶，其性质稳定、较强抗菌活性、对革兰氏菌产生抑制作用，价格低廉、易生产、易获得，因而在畜牧业上被广泛应用。磺胺嘧啶药物在生物体内易吸收、代谢时间长、易残留，因而更易在生物体内积累。长期滥用磺胺嘧啶药物，最终导致过敏性反应、肝肾损伤、磺胺嘧啶药抗药性、细菌耐药性感染、甚至具有致癌性。目前，检测磺胺嘧啶主要经微生物法、高效液相色谱、气相色谱-质谱、高效液相色谱-串联质谱等，微生物法检测速度慢，并且对磺胺药缺乏灵敏性和特异性，液相、气相、质谱等方法则存在前处理繁琐，需要专业人员操作、需要昂贵仪器等缺陷，进样单一检测数度慢，在大规模检测中并不适用。本专利技术磺胺嘧啶经改造后，用于免疫动物产生特异性抗体，采用抗原抗体免疫反应法，能够实现方便、快捷，而且对人员培训要求低等特点。
技术实现思路
本专利技术提供一种磺胺嘧啶抗体制备的关键物质半抗原的合成方法，该方法具有工艺简单，反应率高的特点，收率可达89.55%；最大限度保留了磺胺嘧啶的化学结构，提高了半抗原的特异性。本专利技术是提供一种用于检测磺胺嘧啶残留的半抗原制备的技术方法，分子结构式为式Ⅰ：（式Ⅰ）。反应合成的抗原的分子结构式为式Ⅱ：（式Ⅱ）。反应合成的半抗原的合成方法包括以下步骤：取1.0g对乙酰氨基苯磺酰氯，加吡啶50mL溶解，加2-(2-氨基-5-嘧啶)苯甲醛0.85g，充分搅拌溶解，100℃搅拌4h，停止反应，冷却到室温，旋蒸，除去吡啶，加二氯甲烷/乙醇（v/v,5/1）40mL重结晶，得到磺酰嘧啶1.5g，收率88.75%取磺酰嘧啶1.5g，加2mol/LKOH水溶液80mL溶解，90℃搅拌3h，停止反应，冷却到室温，加6mol/L盐酸调节pH值到7，加乙酸乙酯萃取100mL×3,萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，蒸干，上硅胶柱，乙酸乙酯/正己烷（v/v,1/1）洗脱分离，得到苯甲醛-磺胺嘧啶半抗原1.2g，收率89.55%。磺胺嘧啶反应合成的半抗原的合成路线如下：本专利技术还提供一种磺胺嘧啶抗原的制备方法。1）称取适量磺胺嘧啶半抗原25mg溶解于DMF溶液中，加入EDC和NHS水溶液，进行活化30min，得到溶液I；2）将载体蛋白溶于水溶液中，得到溶液Ⅱ；将溶液I加入到溶液Ⅱ中，常温搅拌24h进行偶联，得到溶液Ⅲ；3）用0.01mol/LPB透析溶液Ⅲ3d，每天更换3次透析袋，-20℃保存。综上所述，本专利技术提供了一种磺胺嘧啶改造方法，涉及工艺简单、易操作、回收率高等优点。经过柱净化浓缩以该半抗原为基础，可与载体蛋白偶联，用于免疫小鼠制备抗体，并以抗原抗体为基础开发胶体金试纸条检测产品。本专利技术提供一种磺胺嘧啶半抗原的应用方案，由磺胺嘧啶半抗原为基础制备试纸条。本专利技术的试纸条由微孔试剂和试纸条两部分构成，所述试纸条由PVC板、吸水垫、反应膜、吸收垫、保护膜五部分构成。所述吸收垫，反应膜，吸水垫和保护膜按顺序粘贴在PVC板上，反应膜上固定检测区(T)和质控区(C)。检测区包被有磺胺嘧啶半抗原-牛血清白蛋白偶联物，质控区包被有羊抗鼠IgG。附图说明图1半抗原结构图式I。图2抗原结构图式Ⅱ。图3半抗原合成技术路线。图4试纸条剖面结构示意图。图5试纸条结果判定。具体实施方式实施例1磺胺嘧啶抗原的制备1、半抗原合成取1.0g对乙酰氨基苯磺酰氯，加吡啶50mL溶解，加2-(2-氨基-5-嘧啶)苯甲醛0.85g，充分搅拌溶解，100℃搅拌4h，停止反应，冷却到室温，旋蒸，除去吡啶，加二氯甲烷/乙醇（v/v,5/1）40mL重结晶，得到磺酰嘧啶1.5g，收率88.75%取磺酰嘧啶1.5g，加2mol/LKOH水溶液80mL溶解，90℃搅拌3h，停止反应，冷却到室温，加6mol/L盐酸调节pH值到7，加乙酸乙酯萃取100mL×3,萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，蒸干，上硅胶柱，乙酸乙酯/正己烷（v/v,1/1）洗脱分离，得到苯甲醛-磺胺嘧啶半抗原1.2g，收率89.55%。2、抗原的制备及鉴定(1)抗原的合成称取25mg磺胺嘧啶半抗原溶解于DMF中，加入EDC和NHS活化30min，加入到BSA水溶液中，调溶液pH7.2-7.6，常温搅拌24h；用0.01mol/LPB透析3d，每天更换3次透析袋，-20℃保存。(2)抗原的鉴定将载体蛋白、磺胺嘧啶半抗原、磺胺嘧啶半抗原-载体蛋白偶联物用pH7.4的PB配成0.5mg/mL的溶液，以0.01mol/LpH7.4的PB调零，用紫外分光光度计在波长200-800nm范围内扫描。得到载体蛋白、磺胺嘧啶半抗原、磺胺嘧啶半抗原-载体蛋白偶联物的吸收曲线。结果显示三者出现不同的吸收曲线，表明磺胺嘧啶半抗原与载体蛋白偶联成功，分子结构式如式Ⅱ所示：（式Ⅱ）。实施例2构建检测试纸条1、试纸条（图4）吸收垫1，反应膜2，吸水垫3和保护膜7按顺序粘贴在PVC板6上，吸收垫末端与反应膜相连，反应膜末端与吸水垫相连，吸收垫始端与PVC板对齐，吸水垫末端与PVC板对齐，保护膜7覆盖吸收垫上，反应膜上固定(T)区4和(C)区5。检测区4包被有磺胺嘧啶半抗原-牛血清白蛋白偶联物，质控区5包被有羊抗鼠IgG。2、微孔试剂微孔试剂含冻干磺胺嘧啶单克隆抗体-胶体金标记物，包被量为0.2-0.5cm3/孔。3、单克隆抗体(1)动物免疫将免疫原注入Balb/c小鼠体内，剂量为50μg/只，使其产生多克隆抗体。(2)细胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按6∶1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并意外发现，其中一株效价显著高于其它杂交瘤细胞株。(3)细胞冻存和复苏将磺胺嘧啶的单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成1×106个/mL的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。(4)单克隆抗体的制备与纯化将Balb/c小鼠腹腔注射灭菌石蜡油，剂量为0.4mL/只，7天后腹腔注射磺胺嘧啶的单克隆杂交瘤细胞株5×105个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，纯化后的腹水放入-20℃环境中保存。4、羊抗鼠IgG以山羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。5、磺胺嘧啶单克隆抗体-胶体金标记物(1)胶体金的制备用双蒸去离子水将1％氯金酸稀释成0.01％，置磁力加热搅拌煮沸，每100mL0.01％的氯金酸加入1mL2％的柠檬酸三钠，继续煮沸，液体呈红色时停止加热，冷却至室温后补足失水。制备好的胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，有效期为一个月。(2)磺胺嘧啶单克隆抗体-胶体金标记物的制备在磁力搅拌下，用0.1MK2CO3调胶体金的pH值至7.8，按1-1.5μg/mL抗体胶体金加入磺胺嘧啶单克隆抗体，继续搅拌混匀30min，加入10％BSA至终浓度为0.5％-1%，静置30min。12000rpm、4℃离心30min，弃去上清液，用初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4℃备用，保存60本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种磺胺嘧啶半抗原改造及其应用，其特征在于涉及磺胺嘧啶药物半抗原及其制备方法，所述磺胺嘧啶半抗原合成路径如下所示:

【技术特征摘要】
1.一种磺胺嘧啶半抗原改造及其应用，其特征在于涉及磺胺嘧啶药物半抗原及其制备方法，所述磺胺嘧啶半抗原合成路径如下所示:根据权利1所述的一种磺胺嘧啶半抗原改造及其应用，所述磺胺嘧啶半抗原结构式如式Ⅰ所示：（式Ⅰ）。2.根据权利1、2所述的一种磺胺嘧啶半抗原改造及其应用，所述应用为一种快速检测磺胺嘧啶残留试纸条，其特征在于由微孔试剂和试纸条两部分构成，所述试纸条包括PVC板、...

【专利技术属性】
技术研发人员：何方洋，万宇平，冯才伟，扶胜，谢体波，袁光宇，钟新敏，吴紫洁，
申请(专利权)人：贵州勤邦食品安全科学技术有限公司，
类型：发明
国别省市：贵州,52