一种复制缺陷型猪圆环病毒、其制备方法及应用技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体涉及复制缺陷型猪圆环病毒、其制备方法及应用。本发明专利技术首先采用人为DNA突变技术敲除野生型PCV的REP基因或CAP基因的正常表达功能得到复制缺陷型PCV，然后采用复制缺陷型PCV感染对应的PCV反式互补基因细胞株，拯救获得复制缺陷型猪圆环病毒。该复制缺陷型病毒具有与野生型PCV毒株完全相同的病毒蛋白一级结构和高级结构以及大小完全相同且序列同源性高达99.77%的基因组DNA，与野生型病毒具有相同的免疫原性和抗原递呈效率，因此其作为预防或治疗PCV感染的PCV疫苗、PCV抗体检测抗原和用作表达外源基因的重组疫苗载体。

【技术实现步骤摘要】
一种复制缺陷型猪圆环病毒、其制备方法及应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种复制缺陷型猪圆环病毒（PCV）、其制备方法及应用。
技术介绍
猪圆环病毒及其相关疾病：猪圆环病毒（Porcinecircovirus，PCV）是迄今发现的一种最小的动物病毒。PCV病毒为单链DNA病毒，现已知PCV有3个亚型，即PCV1、PCV2和PCV3，其中PCV1为非致病性的病毒，PCV3为刚才出现的新型PCV病毒，其致病性目前未知，而PCV2是断奶仔猪多系统衰竭综合症（postweaningmμLtisystemicwastingsyndrome，PMWS）的主要病原。PCV2引起的PMWS最早发现于加拿大（1991），很快在欧美及亚洲一些国家包括我国发生和流行。后来大量的研究发现，除PMWS外，PDNS（猪皮炎与肾病综合征）、PNP（增生性坏死性肺炎）、PRDC（猪呼吸道疾病综合征）、繁殖障碍、先天性颤抖、肠炎等疾病亦与PCV2感染有重要关联。PCV2感染相关的猪病死亡率为10%～30%不等，感染严重的猪场甚至高达40%，给养猪业造成重大的经济损失。此外，大量研究表明PCV2感染能引起猪严重的免疫障碍，从而引起其它继发性传染病（如猪瘟、蓝耳病、链球菌病等）。因此PCV2已被各国公认为对养猪业威胁最大的病毒之一。猪圆环病毒感染的免疫防治技术：与大多数病毒病一样，猪圆环病毒感染目前没有的特异的治疗药物，疫苗是控制猪圆环病毒感染最有效的手段。现在已有多种PCV2全病毒灭活疫苗、原核表达的PCV2-CAP亚单位疫苗和以杆状病毒为载体的真核表达PCV2-CAP亚单位疫苗用于生产实践。但猪圆环病毒感染在世界范围内、特别是在中国仍然是给养猪业造成最大经济损失的传染病，说明这些现有PCV2疫苗的临床防控效果依然欠佳。现有病毒疫苗技术的不足：现有的病毒疫苗按照技术原理的不同主要包括3类，即灭活病毒疫苗、弱毒活疫苗和基因工程亚单位疫苗。灭活疫苗为用灭活的病原体制备的疫苗，安全性很高，但由于灭活过程会导致疫苗的免疫原性改变，且抗原递呈效率低，故免疫防治效果欠佳。弱毒活疫苗是用毒力较低的病毒株制备的疫苗，尽管其因较好的免疫原性和抗原递呈效率而具较好的免疫效果，但是由于弱毒活疫苗在动物体内仍能进行复制传代，而传代过程中病毒可能发生无法预测的突变、进化从而恢复毒力甚至产生毒力更强的毒株，因此弱毒活疫苗的疫苗安全性和生物安全性较低。基因工程亚单位疫苗是用基因工程技术表达的病原体的部分蛋白抗原，安全性虽然较好，但其免疫原性不完整，故其免疫效果也不理想。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供一种复制缺陷型猪圆环病毒的制备方法，该制备方法得到的复制缺陷型PCV病毒具有与野生型PCV病毒完全相同的病毒蛋白一级结构和高级结构以及大小和形状完全相同的病毒粒子，因此具有与野生型PCV病毒具完全有相同的感染能力和免疫原性，且该制备方法得到的复制缺陷型PCV病毒不能在正常的宿主细胞（包括动物活体细胞）内复制传代。本专利技术提供的复制缺陷型猪圆环病毒的制备方法包括以下步骤：（1）PCV反式互补转基因细胞株的构建：通过稳定转染或慢病毒转导技术将野生型PCV的CAP基因或REP基因的真核表达质粒插入任一可复制PCV的细胞株的基因组中即得，优选地，所述任一可复制PCV的细胞株为PK-15细胞株或Vero细胞株；（2）复制缺陷型PCV感染性克隆的构建：通过PCR扩增所选PCV毒株的基因组全长DNA，克隆入质粒载体中，然后通过DNA定点突变技术（site-directedmutagenesis）构建复制缺陷型PCV感染性克隆。优选的，所述DNA定点突变技术是以下三种中的任意一种：①在野生型PCV的CAP基因或REP基因的ORF序列中引入一个或多个提前终止密码子（TAG、TAA或TGA）；②在野生型PCV的CAP基因或REP基因的ORF序列的5’端引入单碱基或双碱基的插入突变或删除突变；③用外源基因整码（in-frame）插入置换CAP基因或REP基因的部分或全部ORF序列；（3）复制缺陷型PCV感染性克隆的转染和病毒拯救与培养：用复制缺陷型PCV感染性克隆通过脂质体转染技术转染上述相应的PCV反式互补转基因细胞株，即可拯救获得复制缺陷型PCV病毒，并通过所述PCV反式互补转基因细胞株培养和制备复制缺陷型PCV。当复制缺陷型感染克隆是通过DNA定点突变CAP获得时，所述相应的PCV反式互补基因细胞株是通过稳定转染或慢病毒转导技术至少将CAP的真核表达质粒转入可复制PCV的细胞株获得的；当复制缺陷型感染克隆是通过DNA定点突变REP获得时，所述相应的PCV反式互补基因细胞株是通过稳定转染或慢病毒转导技术至少将REP的真核表达质粒转入可复制PCV的细胞株获得的。上述复制缺陷型PCV病毒能在上述相应PCV反式互补转基因细胞株中复制传代并得以大量制备复。上述复制缺陷型PCV的基因组为功能缺陷型基因组（其基因组复制所必须的REP基因或子代病毒包装所必须的CAP基因无法正常表达），当其感染正常宿主细胞（指上述PCV反式互补转基因细胞株以外的其它宿主细胞）后不能完成病毒基因组复制或子代病毒粒子的包装而不能产生子代病毒，所以其对正常宿主细胞来说是一种复制缺型病毒（即不能形成有感染能力的子代病毒）。但是，所述复制缺陷型PCV具有与野生型PCV完全相同的病毒衣壳，从而具有与野生型PCV完全相同的感染能力和免疫原性。因此，所述复制缺陷型PCV可以用作预防或治疗猪圆环病毒感染的新型活病毒疫苗，还可作为用作检测PCV抗体的检测抗原。本专利技术所述复制缺陷型猪圆环病毒作为治疗性疫苗可能的机制如下：（1）所述复制缺陷PCV病毒进入已感染野生型PCV的细胞后，其功能缺陷的基因组将与野生型病毒的正常基因组在基因组DNA复制环节发生竞争，从而竞争性抑制野生型病毒基因组的复制效率。（2）其功能缺陷的基因组将与野生型病毒的正常基因组在子代病毒包装环节发生竞争，从而竞争性抑制野生型病毒的子代病毒包装效率。若用外源抗原基因整码（in-frame）插入置换CAP基因的部分ORF序列构建敲除CAP的复制缺陷PCV病毒；该复制缺陷PCV病毒感染进入正常宿主细胞后，虽然不能形成子代病毒颗粒，但其基因组DNA仍能正常进行复制并表达插入的外源抗原基因，从而呈递给免疫系统，激发针对外源抗原的免疫反应，因此，其具有作为表达其它病原微生物抗原基因的重组疫苗载体的潜力。本专利技术所述复制缺陷猪圆环病毒作为表达其它病原微生物抗原基因的重组疫苗载体可能的机制如下：用外源抗原基因整码（in-frame）置换CAP基因的部分或全部ORF序列构建敲除CAP的复制缺陷PCV病毒；该复制缺陷PCV病毒感染进入正常宿主细胞后，虽然不能形成子代病毒颗粒，但其基因组DNA仍能正常进行复制，并表达插入的外源抗原基因，从而呈递给免疫系统，激发针对外源抗原的免疫反应。本专利技术提供的复制缺陷型猪圆环病毒的制备方法也可以应用于圆环病毒科的其它圆环病毒以制备相应的复制缺陷型圆环病毒疫苗。本专利技术中所述猪圆环病毒（PCV）包括PCV1、PCV2、PCV3或将来可能出现的其它亚型的PCV病毒。本专利技术的有益效果在于：与上述3种传统病毒疫苗相比，本专利技术所述复制缺陷PCV用作本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种复制缺陷型猪圆环病毒的制备方法，采用人为DNA突变技术敲除野生型PCV的REP基因或CAP基因的正常表达功能得到复制缺陷型PCV感染性克隆，采用复制缺陷型PCV感染性克隆转染对应的PCV反式互补基因细胞株，拯救获得复制缺陷型PCV。

【技术特征摘要】
1.一种复制缺陷型猪圆环病毒的制备方法，采用人为DNA突变技术敲除野生型PCV的REP基因或CAP基因的正常表达功能得到复制缺陷型PCV感染性克隆，采用复制缺陷型PCV感染性克隆转染对应的PCV反式互补基因细胞株，拯救获得复制缺陷型PCV。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述PCV反式互补基因细胞株是将野生型PCV的CAP基因或REP基因的真核表达质粒插入任一可复制PCV病毒的细胞株获得的。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下三个步骤：（1）PCV反式互补转基因细胞株的构建：通过慢病毒转导或质粒稳定转染将野生型PCV的CAP基因或REP基因的真核表达质粒插入可复制PCV的细胞株的基因组中，获得PCV反式互补转基因细胞株；（2）复制缺陷PCV感染性克隆构建：将野生型PCV的全长DNA克隆入质粒载体中，然后通过人为DNA突变技术敲除CAP基因或REP基因的正常表达功能，获得复制缺陷PCV感染性克隆；（3）复制缺陷型PCV感染性克隆的转染和病毒拯救与培养：采用所述复制缺陷PCV感染性克隆转染...

【专利技术属性】
技术研发人员：马跃，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50