人间充质干细胞培养基及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种人间充质干细胞培养基及其制备方法和应用，包括基础培养基和血清替代物；基础培养基选自L‑氨基酸及其衍生物、L‑抗坏血酸钠、叶酸、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、D‑葡萄糖、酚红、丙酮酸钠和人血白蛋白中的至少一种；血清替代物选自总胆红素、胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、总蛋白质、白蛋白、天冬氨酸氨基转移酶、谷丙转氨酶、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶、葡萄糖、钾、钠、钙、无机磷、氯化物、镁、铁、肌酐、血小板衍生因子、乙型转化生长因子和血管内皮生长因子中的至少一种。实现了未含有动物源成分，步骤简单、原料易得，培养的细胞代次多、增殖能力强、状态好，提高多代次培养后的间充质干细胞纯度的效果。

【技术实现步骤摘要】
人间充质干细胞培养基及其制备方法和应用
本专利技术涉及细胞培养基材料领域，具体地，涉及人间充质干细胞培养基及其制备方法和应用。
技术介绍
干细胞指的是能够自我更新、分裂以及分化成其它细胞类群的一种细胞。间充质干细胞(MSC)是一种多能干细胞，其起源于中胚层，而且来源广泛，可从多种组织如骨髓、脐带、脂肪组织等中分离得到。间充质干细胞具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力，在特定条件下不仅能够分化为中胚层的心肌细胞和软骨细胞，还能分化成外胚层的神经细胞等。间充质干细胞不仅来源丰富，具有多种分化潜能，而且可以在体外长期保存，具有自我更新和无限增殖潜力，还具有影响免疫细胞的增殖分化的功能。间充质干细胞的这些特点为科学研究和医学应用提供了很好的细胞来源。目前临床上间充质干细胞对血液系统疾病(如白血病等)、神经系统疾病(如帕金森氏综合征等)、实质器官损伤或病变(如肝硬化等)、心血管系统疾病(如心肌梗塞等)、代谢性疾病(如糖尿病及其并发症等)、骨关节疾病(如骨关节炎，股骨头坏死)等多种疾病都有不错的应用空间。其所具有的免疫调节特性，使它在免疫性疾病的治疗中也有非常广泛的用途和研究价值。同时间充质干细胞其能稳定表达转染到细胞内的目的基因，因此在基因治疗中也应用广泛，是一种新型的基因治疗靶细胞。另一方面，目前干细胞研究已完成了一系列安全性实验，包括毒性试验、遗传学试验、局部刺激试验、发热试验和免疫毒性试验等，结果表明，干细胞是安全、无毒的。成体干细胞经过多次传代后，没有出现变异现象，也就是说，不会有致瘤的可能。大量的临床资料也表明，干细胞治疗过程中除了极少数病人有短时、轻微的发热、头痛外，没有发现其它显著的副作用或不良反应。然而，在培养过程中，普遍采用动物源培养基进行培养，从而使得其在培养过程中会引入大量动物源性物质，给其自我更新和分化过程带来了很多的不确定因素，造成分化过程中出现误差；同时，还可能在其培养过程中引入动物源性污染，导致间充质干细胞被污染等问题。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的目的在于克服现有技术中对于间充质干细胞的培养往往含有动物源成分，虽然可以保证细胞具有优异的自我更新能力，但是由于培养基中引入大量动物源性物质，给干细胞及其诱导分化的细胞自我更新及分化过程带来了不确定因素，增加了误差；同时可能引入动物源性污染，如支原体污染等；另外，在细胞治疗的过程中还可能会诱发免疫反应等问题，从而提供一种未含有动物源成分，并且能够为培养间充质干细胞提供足够的营养物质和稳定的生存环境，同时其制备方法步骤简单、原料易得，且培养的细胞代次多、增殖能力强、状态好，能够有效提高多代次培养后的间充质干细胞的纯度的细胞培养基及其制备方法和应用。为了实现上述目的，本专利技术提供了一种人间充质干细胞培养基，其中，所述人间充质干细胞培养基包括基础培养基和血清替代物；且，所述基础培养基选自L-氨基酸及其衍生物、L-抗坏血酸钠、叶酸、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、D-葡萄糖、酚红、丙酮酸钠和人血白蛋白中的至少一种；所述血清替代物选自总胆红素、胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、总蛋白质、白蛋白、天冬氨酸氨基转移酶、谷丙转氨酶、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶、葡萄糖、钾、钠、钙、无机磷、氯化物、镁、铁、肌酐、血小板衍生因子、乙型转化生长因子和血管内皮生长因子中的至少一种。本专利技术还提供了一种人间充质干细胞培养基的制备方法，其中，所述制备方法包括：1)将基础培养基和血清替代物混合，制得混合物M1；2)将混合物M1进行pH值的调节，制得混合物M2；3)将混合物M2进行灭菌处理，制得人间充质干细胞培养基；其中，所述基础培养基和所述血清替代物如上所述。本专利技术还提供了一种人间充质干细胞培养基在培养间充质干细胞中的应用，其中，所述人间充质干细胞培养基如上所述或者如上述所述的制备方法制得。通过上述技术方案，本专利技术以基础培养基和血清替代物进行混合，并将基础培养基和血清替代物各自限定为特定的原料，通过各原料之间的协同作用为间充质干细胞提供更为有效的营养和更为稳定的培养环境，使其能够具有更为优异的自我更新和分化能力。并且，本技术方案中没有使用动物源成分，有效规避了由于动物源性物质对培养细胞的自我更新及分化过程带来了不确定因素以及对培养细胞造成污染的情况的发生，并且能够在细胞治疗的过程中完全避免诱发免疫反应的发生。本专利技术的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。附图说明附图是用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本专利技术，但并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1是检测例中使用的脐带间充质干细胞的形态特征图；图2是检测例中的脐带间充质干细胞的增值倍数图；图3是检测例中脐带间充质干细胞在P5代时其CD14的流式检测结果；图4是检测例中脐带间充质干细胞在P5代时其CD19的流式检测结果；图5是检测例中脐带间充质干细胞在P5代时其CD34的流式检测结果；图6是检测例中脐带间充质干细胞在P5代时其CD45的流式检测结果；图7是检测例中脐带间充质干细胞在P5代时其HLA-DR的流式检测结果；图8是检测例中脐带间充质干细胞在P5代时其CD73的流式检测结果；图9是检测例中脐带间充质干细胞在P5代时其CD90的流式检测结果；图10是检测例中脐带间充质干细胞在P15代时其CD14的流式检测结果；图11是检测例中脐带间充质干细胞在P15代时其CD19的流式检测结果；图12是检测例中脐带间充质干细胞在P15代时其CD34的流式检测结果；图13是检测例中脐带间充质干细胞在P15代时其CD45的流式检测结果；图14是检测例中脐带间充质干细胞在P15代时其HLA-DR的流式检测结果；图15是检测例中脐带间充质干细胞在P15代时其CD73的流式检测结果；图16是检测例中脐带间充质干细胞在P15代时其CD90的流式检测结果。具体实施方式以下对本专利技术的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限制本专利技术。在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。本专利技术提供了一种人间充质干细胞培养基，其中，所述人间充质干细胞培养基包括基础培养基和血清替代物；且，所述基础培养基选自L-氨基酸及其衍生物、L-抗坏血酸钠、叶酸、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、D-葡萄糖、酚红、丙酮酸钠和人血白蛋白中的至少一种；所述血清替代物选自总胆红素、胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、总蛋白质、白蛋白、天冬氨酸氨基转移酶、谷丙转氨酶、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶、葡萄糖、钾、钠、钙、无机磷、氯化物、镁、铁、肌酐、血小板衍生因子、乙型转化生长因子和血管内皮生长因子中的至少一种。本专利技术以基础培养基和血清替代物进行混合，并将基础培养基和血清替代物各自限定为特定的原料，通过各原料之间的协同作用为间充质干细胞提供更为有效的营养和更为稳定的培养环境，使其能够具有更为优异的自我更新和分化能力。并本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人间充质干细胞培养基，其特征在于，所述人间充质干细胞培养基包括基础培养基和血清替代物；且，所述基础培养基选自L‑氨基酸及其衍生物、L‑抗坏血酸钠、叶酸、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、D‑葡萄糖、酚红、丙酮酸钠和人血白蛋白中的至少一种；所述血清替代物选自总胆红素、胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、总蛋白质、白蛋白、天冬氨酸氨基转移酶、谷丙转氨酶、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶、葡萄糖、钾、钠、钙、无机磷、氯化物、镁、铁、肌酐、血小板衍生因子、乙型转化生长因子和血管内皮生长因子中的至少一种。

【技术特征摘要】
1.一种人间充质干细胞培养基，其特征在于，所述人间充质干细胞培养基包括基础培养基和血清替代物；且，所述基础培养基选自L-氨基酸及其衍生物、L-抗坏血酸钠、叶酸、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、D-葡萄糖、酚红、丙酮酸钠和人血白蛋白中的至少一种；所述血清替代物选自总胆红素、胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、总蛋白质、白蛋白、天冬氨酸氨基转移酶、谷丙转氨酶、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶、葡萄糖、钾、钠、钙、无机磷、氯化物、镁、铁、肌酐、血小板衍生因子、乙型转化生长因子和血管内皮生长因子中的至少一种。2.根据权利要求1所述的细胞培养基，其中，所述L-氨基酸及其衍生物选自L-丙氨酸、L-精氨酸盐酸盐、L-天冬酰胺一水物、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐一水物、L-胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸盐酸盐一水物、L-异亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸中的至少一种。3.根据权利要求1或2所述的细胞培养基，其中，以所述细胞培养基的总量为基准，所述基础培养基的含量为90-98体积％，所述血清替代物的含量为2-10体积％。4.根据权利要求1或2所述的细胞培养基，其中，L-氨基酸及其衍生物的含量为20-200mg/L，L-抗坏血酸钠的含量为1-5mg/L，叶酸的含量为2-5mg/L，磷酸二氢钠的含量为109-125mg/L，碳酸氢钠的含量为1-5g/L，D-葡萄糖的含量为500-1000mg/L，酚红的含量为10-15mg/L，丙酮酸钠的含量为5-30mg/L，人血白蛋白的含量为1-5g/L。5.根据权利要求1或2所述的细胞培养基，其中，总胆红素的含量为50-250μmol/L，胆固醇的含量为20-60mmol/L，高密度脂蛋白的含量为5-20mmol/L，低密度脂蛋白的含量为不大于40mmol/L，甘油三酯的含量为5-20mmol/L，总蛋白质的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张竞方，孙亚平，
申请(专利权)人：宁波医诺生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33