本发明专利技术公开了一种用于治疗代谢疾病的瘦素融合蛋白及其制备方法和应用，属于瘦素及成纤维细胞生长因子21技术领域。本发明专利技术的技术方案要点为：用于治疗代谢疾病的瘦素融合蛋白是由人FGF21蛋白的N端与人Leptin蛋白融合而成的，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。本发明专利技术还公开了该用于治疗代谢疾病的瘦素融合蛋白的制备方法及其作为治疗糖尿病、肥胖症或代谢综合症药物中的应用。本发明专利技术提供的瘦素融合蛋白hLeptin‑hFGF21在糖尿病肥胖模型小鼠上具有良好的降糖和降脂作用，并在体重改善方面也表现出了显著的效果。
【技术实现步骤摘要】
一种用于治疗代谢疾病的瘦素融合蛋白及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种用于治疗代谢疾病的瘦素融合蛋白，本专利技术还涉及该人瘦素（Leptin）和人成纤维细胞生长因子21（FGF21）融合蛋白的制备方法及其在制备治疗代谢疾病药物中的用途，属于瘦素及成纤维细胞生长因子21
技术介绍
糖尿病是一种由多种病因引起的血中胰岛素绝对或相对不足，导致血糖过高，出现糖尿，进而引起脂肪和蛋白质代谢紊乱的非传染性慢性代谢类疾病，临床上可出现多尿、烦渴、多饮、多食，消瘦等表现，重者容易发生酮症酸中毒等急性并发症或血管、神经等慢性并发症。其患病率、致残率、病死率以及总体健康危害程度，是继心脑血管疾病和癌症之后人类第3大杀手。随着糖尿病在世界范围内发病率日益增加，严重威胁着人类的健康，目前虽已有多种治疗药物，但都具有疗效有限且存在安全性问题的缺点。因此，研制治疗糖尿病有效的新药及制定有效的治疗方案成为许多国家共同努力的目标。肥胖是一种以身体脂肪含量过多的重要特征的、多病因的、能够并发多种疾病的的慢性病。肥胖发生的原因很多，如饮食、遗传、内分泌失调、精神、生理、环境、运动少等因素，其中摄入过多和运动减少，导致热能入超，造成脂肪堆积，是当今世界肥胖群体增加的普遍原因。肥胖不仅可以影响到机体器官结构，还与一系列的疾病相关，肥胖者多易患肥胖并发症（脂肪肝，糖尿病等）。不仅如此，肥胖是一种慢性炎症或有的称其是一种前炎性状态，肥胖者体内IL-6、TNF-α和C反应蛋白（CRP）等炎性因子的提高在肥胖的并发症如2型糖尿病、高血压、动脉粥样硬化（AS）中起着重要作用。并且有研究报道，腹型肥胖和腹部脂肪所占比例增加是冠心病和2型糖尿病及相关死亡的主要危险因素。目前，肥胖症已被世界卫生组织列为与癌症并列的21世纪威胁人类健康的最严重的疾病。据世界卫生组织预测，到2015年全世界肥胖人群的数字将达到7亿，而体重超标的人将会达到令人震惊的23亿。故研究肥胖症及其相关疾病的病因及防治措施已成为紧迫的课题。1994年Zhang等首次成功地克隆了小鼠的肥胖基因（obesegene，ob）ob基因及人类的同源序列。ob基因及表达产物-瘦素（Leptin）的发现使肥胖的研究获得突破性进展，而且近年瘦素与2型糖尿病的研究亦成为热点。在人类基因组中，ob基因是单拷贝序列，全长20kb，位于7q31处，包含二个内含子和三个外显子，Leptin为ob基因的表达产物，由146个氨基酸组成的单链蛋白质。Leptin由脂肪组织分泌后，进入血循环与瘦素受体结合，通过下丘脑调节食欲、能量消耗而控制体重。Leptin的作用包括中枢和外周性，Leptin作用除通过中枢神经系统，还可通过脂肪组织的Leptin受体直接抑制脂肪组织中脂类的合成。Leptin在调节机体摄食和能量代谢中发挥重要作用，在神经内分泌、血管新生、生殖、免疫调节和创伤修复等方面的作用也渐渐被人们重视，同时Leptin在肥胖、糖尿病、心血管疾病和缺血再灌注损伤等方面的作用也被重视。2000年，TetsuyaNishimura等人最先在小鼠胚胎中分离出FGF家族中的一个新成员并将其命名为成纤维细胞生长因子-21（FGF21）。FGF21是成纤维细胞生长因子家族的一名新成员，主要在肝脏中表达，蛋白N端前28个氨基酸为信号肽（去除信号肽后的多肽为成熟肽），因此FGF21可以分泌到细胞外。FGF21具有调节血糖、降低血脂和改善胰岛素抵抗等作用，在医药领域有着广泛的应用前景。但长期的研究及临床实验结果显示，FGF21和瘦素使用剂量高，与其它蛋白药物一样，稳定性差、体内半衰期短、易产生抗原抗体反应，这直接影响了其在临床上的治疗效果。本专利技术将FGF21和Leptin基因融合表达，不但增加了蛋白的可溶性表达量，并且可以显著提高其降低血糖、体重及血脂的能力，进而为糖尿病和肥胖症的治疗提供更安全、经济和有效的候选药物。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了一种用于治疗代谢疾病的瘦素融合蛋白及其氨基酸序列和瘦素融合蛋白编码基因的核苷酸序列，还提供了含有人FGF21基因和其与人Leptin基因连接的表达载体以及含有该表达载体的宿主细胞，瘦素融合蛋白可作为药物用于治疗糖尿病、肥胖症或代谢综合症等代谢疾病。本专利技术为实现上述目的采用如下技术方案，一种用于治疗代谢疾病的瘦素融合蛋白，其特征在于：所述瘦素融合蛋白是由人FGF21蛋白的N端与人Leptin蛋白融合而成的，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO:2所示。优选的，所述瘦素融合蛋白编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:1所示。优选的，所述瘦素融合蛋白编码基因由人FGF21核苷酸序列与人Leptin基因片段通过连接肽连接而成。优选的，所述连接肽为GSlinker（(Gly4Ser)3）。优选的，含有瘦素融合蛋白编码基因的表达载体为pET-30a，含有瘦素融合蛋白编码基因的宿主细胞为大肠杆菌BL21。本专利技术所述的用于治疗代谢疾病的瘦素融合蛋白的制备方法，其特征在于具体过程为：将人Leptin基因通过连接肽GSlinker连接到人FGF21基因的N端得到编码瘦素融合蛋白的核苷酸序列，再将得到的编码瘦素融合蛋白的核苷酸序列与表达载体相连接得到重组表达载体；然后将重组表达载体导入大肠杆菌感受态细胞中；筛选稳定高效表达目标蛋白的重组菌，培养细胞并诱导表达融合蛋白，收集菌体、破碎、离心、变性、复性、纯化得到瘦素融合蛋白。优选的，将重组表达载体转化表达菌株BL21（DE3），转化后的单菌落分别接种至20mL含50μg/mLKan的LB培养基中，于37℃培养10h，以体积比1:100接种于另一20mL含50μg/mLKan的LB培养基中，于37℃培养，当A600在0.35时，在温度为30℃、IPTG终浓度为0.25mmol/L、转速为60r/min的条件下诱导5h，在此条件下进行表达瘦素融合蛋白时，能够显著提高融合蛋白的表达水平。优选的，将重组表达载体转化宿主细胞，筛选稳定高表达阳性克隆后培养并诱导表达目标融合蛋白，离心收集菌体，超声破碎，离心，对澄清后的上清液进行离子交换层析和凝胶过滤层析分离纯化目标融合蛋白，最终得到高纯度瘦素融合蛋白。本专利技术所述的瘦素融合蛋白作为治疗糖尿病、肥胖症或代谢综合症药物中的应用。本专利技术与现有技术相比具有以下有益效果：本专利技术通过细胞试验和动物学试验结果表明，所得瘦素融合蛋白hLeptin-hFGF21相比于hLeptin或hFGF21，生物学活性显著提高，能够更加有效降低糖尿病肥胖小鼠体内的血糖及血脂水平，本专利技术的瘦素融合蛋白还能较好的控制体重变化。另外，本专利技术的瘦素融合蛋白可作为药物治疗糖尿病、肥胖症或代谢综合症等代谢疾病。附图说明图1是瘦素融合蛋白hLeptin-hFGF21在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE分析图；图2是经纯化后的瘦素融合蛋白hLeptin-hFGF21的SDS-PAGE分析图；图3是瘦素融合蛋白hLeptin-hFGF21调节ob/ob小鼠血糖水平变化；图4是瘦素融合蛋白hLeptin-hFGF21调节ob/ob小鼠体重变化；图5是瘦素融合蛋白hLeptin-hFGF21调节ob/ob小鼠糖耐量变化；图6是瘦素融合蛋白hLeptin-hF本文档来自技高网...
【技术保护点】
1. 一种用于治疗代谢疾病的瘦素融合蛋白，其特征在于：所述瘦素融合蛋白是由人FGF21蛋白的N端与人Leptin蛋白融合而成的，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。
【技术特征摘要】
1.一种用于治疗代谢疾病的瘦素融合蛋白，其特征在于：所述瘦素融合蛋白是由人FGF21蛋白的N端与人Leptin蛋白融合而成的，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO:2所示。2.根据权利要求1所述的用于治疗代谢疾病的瘦素融合蛋白，其特征在于：所述瘦素融合蛋白编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:1所示。3.根据权利要求2所述的用于治疗代谢疾病的瘦素融合蛋白，其特征在于：所述瘦素融合蛋白编码基因由人FGF21核苷酸序列与人Leptin基因片段通过连接肽连接而成。4.根据权利要求3所述的用于治疗代谢疾病的瘦素融合蛋白，其特征在于：所述连接肽为GSlinker（(Gly4Ser)3）。5.根据权利要求1所述的用于治疗代谢疾病的瘦素融合蛋白，其特征在于：含有瘦素融合蛋白编码基因的表达载体为pET-30a，含有瘦素融合蛋白编码基因的宿主细胞为大肠杆菌BL21。6.一种权利要求1所述的用于治疗代谢疾病的瘦素融合蛋白的制备方法，其特征在于具体过程为：将人Leptin基因通过连接肽GSlinker连接到人FGF21基因的N端得到编码瘦素融合蛋白的核苷酸序列，再将得到的编码瘦素融合蛋白的核苷酸序列与表达载体相连接得到重组表达...
【专利技术属性】
技术研发人员：叶贤龙，齐剑英，吴云舟，朱升龙，
申请(专利权)人：河南师范大学，
类型：发明
国别省市：河南,41
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。